Tuberkuloosi laboratoorne diagnoosimine

Tuberkuloos on haigus, mida on tänapäeva tingimustes ja teaduslike saavutuste juures lihtne diagnoosida. Tuberkuloosi laboratoorne diagnostika on teiste diagnostiliste meetodite seas kesksel kohal, jäädes alla vaid röntgenuuringute meetoditele.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Kliiniline vereanalüüs

Tuberkuloosihaigetel ei ole üldise vereanalüüsi muutused patognomoonilised. Piiratud ja madala aktiivsusega tuberkuloosi vormide puhul on iseloomulik normaalse arvuga erütrotsüütide hüpokroomia. Massiivsete infiltraatide või kaseoosse kopsupõletiku, laialt levinud kaseoosse lümfadeniidi, spetsiifilise soolekahjustuse, samuti ulatuslike kopsu- või postoperatiivsete verejooksude korral täheldatakse erütropeeniat ja mikrotsütoosi, oligokromaagiat ja polükromaagiat. Makrotsütoosi ja eriti poikilotsütoosi esineb palju harvemini, tavaliselt raske aneemia korral. Retikulotsüütide arv tuberkuloosi kompenseeritud staadiumis varieerub 0,1–0,6%, subkompenseeritud staadiumis 0,6–1,0% ja dekompenseeritud staadiumis on iseloomulik 1% retikulotsüütidest.

Mõnel tuberkuloosi juhul võib täheldada mõõdukat leukotsütoosi (kuni 15 tuhat leukotsüüti), harvemini leukopeeniat, mis esineb 2–7% juhtudest patsientidel, kellel on protsessi piiratud ja kerge vorm, ning 12,5% destruktiivse ja progresseeruva kopsutuberkuloosi korral.

Kõige sagedamini esinevad nihked leukotsüütide valemis. Täheldatakse nii suhtelist kui ka absoluutset neutrofiiliat, leukotsüütide valemis on mõõdukas nihe vasakule promüelotsüütide suunas. Müelotsüüte esineb väga harva tüsistusteta tuberkuloosi korral. Patoloogilise granulaarsusega neutrofiilide arvu suurenemine tuberkuloosihaige patsiendi hemogrammis näitab alati protsessi kestust: raske tuberkuloosiga patsientidel on peaaegu kõik neutrofiilid patoloogilise granulaarsusega. Kui tuberkuloosipuhang vaibub, normaliseerub tuuma nihe suhteliselt kiiresti. Neutrofiilide patoloogiline granulaarsus püsib tavaliselt kauem kui muud muutused hemogrammis.

Eosinofiilide sisaldus perifeerses veres kõigub samuti sõltuvalt protsessi faasist ja organismi allergilisest seisundist. Nende arv väheneb aneosinofiiliani haiguse raskete ja pikaajaliste puhangute korral ning vastupidi suureneb infiltraatide ja pleuraefusiooni resorptsiooni ajal, samuti primaarse tuberkuloosi varajaste vormide korral.

Enamiku primaarse tuberkuloosi vormidega kaasneb lümfopeenia, mida mõnikord täheldatakse isegi mitu aastat pärast spetsiifiliste muutuste armistumist. Ägeda faasi sekundaarne tuberkuloos, olenevalt protsessi raskusastmest, võib kaasneda kas normaalne lümfotsüütide arv või lümfopeenia.

Tuberkuloosiprotsessi hindamiseks mõeldud testide hulgas on eriline koht erütrotsüütide settereaktsiooni (ESR) määramisel, mis on oluline tuberkuloosiprotsessi kulgu hindamisel ja selle aktiivsete vormide tuvastamisel. ESR-i tõus näitab patoloogilise protsessi (nakkus-põletikuline, mädane, septiline, hemoblastoos, lümfogranulomatoos jne) olemasolu ja on selle raskusastme näitaja, kuid normaalsed ESR-i väärtused ei näita alati patoloogia puudumist. Erütrotsüütide settereaktsiooni kiirenemist soodustab globuliinide, fibrinogeeni, kolesterooli sisalduse suurenemine veres ja vere viskoossuse vähenemine. Erütrotsüütide settereaktsiooni aeglustumine on iseloomulik seisunditele, millega kaasneb hemokontsentratsioon, albumiinide ja sapphapete sisalduse suurenemine.

Tuberkuloosihaigete hemogramm muutub ravi ajal. Mida edukam on terapeutiline sekkumine, seda kiiremini kaovad hematoloogilised muutused. Samal ajal tuleb meeles pidada erinevate antibakteriaalsete ravimite mõju vereloomele. Need põhjustavad sageli eosinofiiliat, mõnel juhul leukotsütoosi ja sagedamini leukopeeniat kuni agranulotsütoosi ja lümfoid-retikulaarse reaktsioonini. Süstemaatiline hematoloogiline jälgimine ja saadud andmete korrektne analüüs on patsiendi kliinilise seisundi, protsessi dünaamika ja ravi efektiivsuse hindamiseks hädavajalik.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Kliiniline uriinianalüüs

Kuseteede tuberkuloosi korral on peamine laboratoorne diagnostiline meetod uriinianalüüs. Võib täheldada leukotsütuuriat, erütrotsütuuriat, proteinuuria, hüpoisostenuuriat, tuberkuloosset mükobakteriuuriat, mittespetsiifilist bakteriuuriat.

Leukotsütuuria on kuseteede tuberkuloosi kõige sagedasem sümptom enne spetsiifilist keemiaravi ja puudub ainult erandjuhtudel, näiteks kusejuha valendiku täielikul obliteratsioonil. Netšiporenko test (leukotsüütide arvu määramine 1 ml uriinis) aitab objektiivsemalt hinnata leukotsütuuria astet nefrotuberkuloosi korral ja mõnel juhul seda tavalise uriinianalüüsiga tuvastada. Siiski tuleb arvestada, et leukotsütuuria võib esineda ägeda ja kroonilise püelonefriidi, tsüstiidi, uretriidi, neerukivide ja kusejuhade korral.

Erütrotsütuuriat, nagu ka leukotsütuuriat, peetakse urogenitaaltuberkuloosi üheks levinumaks laboratoorseks tunnuseks. Hematuuria esinemissagedus sõltub protsessi levimusest; see suureneb neerus destruktiivse tuberkuloosse protsessi arenedes. Leukotsütuuriata erütrotsütuuria on neerutuberkuloosi algstaadiumis tüüpilisem. Leukotsütuuria ülekaalus olev hematuuria on oluline argument neerutuberkuloosi kasuks selle eristamisel mittespetsiifilisest püelonefriidist.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Biokeemiline vereanalüüs

Tuberkuloosi korral sõltuvad mõnede biokeemiliste näitajate muutused peamiselt protsessi faasist, tüsistustest ja erinevatest kaasuvatest haigustest. Kopsude ja teiste organite inaktiivse tuberkuloosiga patsientidel ei muutu vereseerumi koguvalk ja valgufraktsioonid ning määravad nende normaalse sisalduse.

Haiguse ägedate vormide, samuti krooniliste tuberkuloosi vormide ägenemise ja progresseerumise korral väheneb albumiini-globuliini koefitsient.

Tuberkuloosi ja selle tüsistuste korral maksa funktsionaalse seisundi ja orgaanilise kahjustuse hindamisel on olulise tähtsusega otsese ja üldbilirubiini, aspartaataminotransferaasi (AST) ja alaniini aminotransferaasi (ALT) määramine vereseerumis. Aminotransferaaside taseme dünaamiline määramine. Bilirubiini sisaldus tuberkuloosihaigete ravis, eriti selle rasketes vormides, on tuberkuloosihaigete biokeemilise uuringu kohustuslik komponent ja seda tehakse igakuiselt.

Neerude funktsionaalse seisundi hindamine hõlmab seerumi kreatiniini määramist ja glomerulaarfiltratsiooni kiiruse arvutamist Cockcroft-Gaulti valemi abil. Glomerulaarfiltratsiooni kiiruse arvutamine Rebergi testi abil annab vähem täpseid tulemusi.

Tuberkuloosihaigete dünaamiliste biokeemiliste uuringute peamine eesmärk on jälgida protsessi kulgu, ravimite kõrvaltoimete õigeaegset avastamist ja tekkivate homöostaasi häirete piisavat korrigeerimist.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Biokeemiliste uurimismeetodite rakendamine kopsuvälise tuberkuloosi korral

Kõige informatiivsemaks indikaatoriks peetakse tuberkulosteariinhappe sisaldust bioloogilistes vedelikes, kuid selle määramine on seotud tehniliste raskustega (vajadus kasutada gaasikromatograafiat ja massispektromeetriat).

Paljutõotav on mõõta adenosiindeaminaasi aktiivsust - ensüümi, mida määratakse vedelikes: sünoviaal-, perikardi-, astsiidi- või tserebrospinaalvedelikes. Adenosiindeaminaasi peamised tootjad on lümfotsüüdid ja monotsüüdid. Adenosiindeaminaasi aktiivsuse määramine bioloogilistes vedelikes hõlbustab tuberkuloosse sünoviidi, lümfisõlmede tuberkuloosi, tuberkuloosse meningiidi ja tuberkuloosse serosiidi diagnoosimist.

Mõned biokeemilised näitajad määratakse oma mittespetsiifilisuse tõttu ainult kahjustuse lähedal asuvates bioloogilistes vedelikes. Indikaatorite taset mõõdetakse vastusena tuberkuliini subkutaansele või intradermaalsele manustamisele (tavaliselt enne manustamist ning 48 ja 72 tundi pärast seda). Seejärel arvutatakse markeri taseme tõusu aste (protsentides) algtaseme suhtes.

Optimaalselt määratakse organspetsiifilise ensüümi transamidinaasi aktiivsus uriinis; selle esinemist täheldatakse erineva päritoluga neerukahjustuse korral. Transamidinaasi uuring on õigustatud ainult tuberkuliini subkutaanse manustamise tingimustes, et süvendada kohalikku põletikulist protsessi. Transamidinaasi aktiivsus määratakse uriinis esialgu ja 24-72 tundi pärast 50 TE tuberkuliini manustamist. Fermentuuria suurenemine 2 või enam korda võimaldab 82% juhtudest eristada neerude aktiivset tuberkuloosi kroonilise püelonefriidi ägenemisest.

Naiste suguelundite tuberkuloosi korral määratakse haptoglobiini ja malondialdehüüdi kontsentratsioon veres provokatiivse tuberkuliinitesti tingimustes. Tuberkuliini manustatakse subkutaanselt annuses 50 TE ja 72 tunni pärast tehakse korduv biokeemiline uuring. Tuberkuloosse etioloogia korral on haptoglobiini taseme tõus vähemalt 28% ja malondialdehüüdi tase 39% või rohkem. Kasutatakse ka adenosiindeaminaasi aktiivsuse määramist Douglase kotikesest saadud kõhukelmevedelikus. Punktsiooni uuritakse uuesti 72 tundi pärast tuberkuliini intradermaalset manustamist annustes 0,1 TE ja 0,01 TE sisemiste suguelundite projektsiooni piirkonnas eesmisele kõhuseinale. Adenosiindeaminaasi aktiivsuse suurenemine 10% või rohkem võrreldes algväärtusega viitab tuberkuloossele protsessile.

Silmakahjustuse korral uuritakse silmas antigeeni stimulatsioonile reageerimisel tekkivat fokaalset reaktsiooni. Sellisel juhul ei ole soovitav järsult väljendunud reaktsiooni teke, millega kaasneb nägemisfunktsioonide langus. Kuna minimaalsete fokaalsete reaktsioonide hindamine on sageli keeruline, on järelduse objektiivseks kinnitamiseks soovitatav paralleelselt keskenduda haptoglobiini või adenosiindeaminaasi suurenemise astmele vereseerumis.

Kõik biokeemilised uuringud tuleks läbi viia koos teiste meetoditega.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Vere hüübimissüsteemi uuring

Vere hüübimissüsteemi seisundi uurimise olulisus ftisioloogias tuleneb hemoptüüsi ehk kopsuverejooksude esinemisest paljudel kopsutuberkuloosiga patsientidel, samuti hemokoagulatsiooni tüsistustest tuberkuloosi kirurgilises ravis. Lisaks mõjutab loomulikult kaasnev latentne intravaskulaarne hemokoagulatsioon haiguse kulgu ja keemiaravi efektiivsust.

Kopsutuberkuloosiga patsientidel, kellel on domineeriv eksudatiivne põletiku komponent, täheldatakse vere antikoagulantse aktiivsuse vähenemist. Patsientidel, kellel on madal spetsiifilise kopsukahjustuse levimus ja domineeriv produktiivne põletiku komponent, on intravaskulaarne hemokoagulatsioon ebaoluline. Kopsutuberkuloosiga patsientidel, kellel esineb hemoptüüsi ja kopsuverejookse, on vere hüübimissüsteemi seisund erinev: patsientidel, kellel on väike verekaotus hemoptoea haripunktis või vahetult pärast selle lakkamist, täheldatakse vere hüübimisvõime järsku suurenemist trombiini moodustumise protsesside väljendunud intensiivistumise tõttu, säilitades samal ajal suurenenud "struktuurilise" hüübivuse. Massiivse verekaotusega patsientidel täheldatakse hüübimispotentsiaali vähenemist fibrinogeeni kontsentratsiooni, XIII faktori aktiivsuse ja trombotsüütide arvu vähenemise tõttu. Piiratud kopsutuberkuloosi vormidega patsientide kirurgilise ravi etapis ei esine homöostaasisüsteemis olulisi häireid. Laialt levinud protsessidega patsientidel tekib pneumonektoomia või pleuropneumonektoomia tegemisel sageli DIC-sündroom, mis võib avalduda "teise haigusena".

Kopsutuberkuloosiga patsientide vere hüübimissüsteemi seisundi jälgimiseks on vaja määrata aktiveeritud osaline tromboplastiini aeg (APTT), fibrinogeen, trombiini aeg, protrombiiniindeks, samuti veritsusaeg ja vere hüübimisaeg.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Hormonaalsed uuringud

Kaasaegsed eksperimentaalsed ja kliinilised vaatlused näitavad hormonaalse staatuse muutuste esinemist spetsiifilise kopsude tuberkuloosse põletiku korral. On tõestatud, et hüpofüüsi-neerupealise, hüpofüüsi-kilpnäärme süsteemide ja kõhunäärme funktsiooni düsfunktsiooni korrigeerimine koos tuberkuloosivastase raviga aitab kaasa fibrogeneesi ja reparatsiooniprotsesside aktiveerimisele spetsiifilise põletiku fookuses.

Hüpofüüsi-kilpnäärme süsteemi funktsionaalset seisundit hinnatakse trijodotüroniini (T3), türoksiini (T4) ja hüpofüüsi kilpnääret stimuleeriva hormooni (TSH) sisalduse järgi vereseerumis _. On kindlaks _tehtud, et subkliinilist hüpotüreoidismi avastatakse 38–45%-l kopsutuberkuloosiga patsientidest ning seda diagnoositakse kõige sagedamini protsessi dissemineerunud ja fibroos-kavernoossete vormide korral. Nende vormide korral on nii T3 kui ka T4 tase kõige järsumalt langenud _{ning nende hormoonidetasakaalustamatus ilmneb T4/} T3 _suhte suurenemise näol.

Neerupealise koore funktsiooni hinnatakse seerumi kortisooli taseme järgi ja kõhunäärme endokriinset funktsiooni immunoreaktiivse insuliini kontsentratsiooni järgi. Nakkushaiguse ägedas faasis suureneb endogeense kortisooli ja insuliini vajadus. Hüperinsulineemia näitab ka kehakudede insuliiniresistentsust, mis on tüüpiline iga aktiivse põletikulise protsessi, eriti spetsiifilise protsessi korral. Neerupealiste glükokortikoidfunktsiooni määramine aktiivse kopsutuberkuloosi korral võimaldab meil tuvastada hüperkortitsismi esinemist enamikul patsientidest. Normaalset kortisooli kontsentratsiooni veres infektsioosse põletikuga patsiendil ägedas perioodis tuleks pidada neerupealise koore glükokortikoidfunktsiooni suhteliseks puudulikkuseks, mis võib olla aluseks asendusraviks piisavate glükokortikoidide annustega.

Peaaegu kolmandikul kopsutuberkuloosiga patsientidest on insuliini tase madal, normi alumisele piirile lähenev, samas kui 13–20%-l on märkimisväärne hüperinsulinism. Nii suhteline hüpo- kui ka hüperinsulinism on kõrge riskitegurid erineva raskusastmega süsivesikute ainevahetushäirete tekkeks. Need muutused pankrease B-rakkude funktsionaalses aktiivsuses nõuavad tuberkuloosihaigetel regulaarset glükeemia jälgimist ja suhkurtõve õigeaegset ennetamist. Lisaks on see täiendav põhjendus insuliini füsioloogiliste annuste kasutamise sobivusele tuberkuloosi kompleksravis.

Üldiselt on kilpnäärmehormoonide taseme langus, nende tasakaalutus, hüperkortisoleemia ja hüperinsulinism kõige enam väljendunud patsientidel, kellel on tuberkuloosiprotsessi raske kulg, ulatuslikud kopsukahjustused ja väljendunud tuberkuloosimürgistuse sümptomid.

Tuberkuloosi mikrobioloogiline diagnostika

Mikrobioloogilised uuringud on vajalikud tuberkuloosihaigete tuvastamiseks, diagnoosi kinnitamiseks, keemiaravi jälgimiseks ja korrigeerimiseks, ravi tulemuste hindamiseks ehk teisisõnu alates tuberkuloosihaige registreerimisest kuni tema registrist kustutamiseni.

Kõik epidemioloogilised programmid ja projektid põhinevad bakterite eritajate arvu hindamisel, mida on võimatu teha ilma tuberkuloosi mükobakterite tuvastamise laboratoorsete meetodite kasutamiseta. Nn organiseerimata populatsiooni ligitõmbavuse uurimisel ulatub bakterite eritajate osakaal 70-ni või rohkem, mis teeb laboratoorsetest meetoditest üsna tõhusa vahendi tuberkuloosihaigete tuvastamiseks selles populatsioonirühmas.

Tuberkuloosi diagnoosimise traditsioonilised mikrobioloogilised meetodid on bakterioskoopilised ja kultuuriuuringud. Kaasaegsete meetodite hulka kuuluvad tuberkuloosi mükobakterite kultiveerimine automatiseeritud süsteemides ja PCR. Kõiki neid meetodeid kombineeritakse aga tingimata klassikaliste bakterioloogiliste meetoditega.

Diagnostilise materjali kogumine

Laboratoorsete testide efektiivsus sõltub suuresti diagnostilise materjali kvaliteedist. Diagnostilise materjali kogumise, säilitamise ja transportimise eeskirjade järgimine ning patsiendi läbivaatuse algoritmi täpne rakendamine mõjutab otseselt tulemust ja tagab bioloogilise ohutuse.

Tuberkuloosi testimiseks kasutatakse mitmesuguseid materjale. Kuna kopsutuberkuloos on tuberkuloosse infektsiooni kõige levinum vorm, peetakse peamiseks testimismaterjaliks röga ja muud tüüpi trahheobronhiaalpuu eritisi: ülemiste hingamisteede eritised, mis on saadud pärast aerosoolide sissehingamist: bronhide loputusvesi; bronhoalveolaarsed loputused; bronhoskoopia, transtrahheaalse ja intrapulmonaalse biopsia käigus saadud materjal: bronhiaaspiraat, kõriplaastrid, eritised, haavaplaastrid jne.

Uuringu efektiivsus suureneb, kui patsiendilt viiakse läbi kontrollitud materjali kogumine. Selleks eraldatakse spetsiaalselt varustatud ruum või ostetakse spetsiaalsed kabiinid. Materjali kogumine on ohtlik protseduur, seetõttu tuleb uuringumaterjali koguda nakkusohutuse eeskirju järgides.

Mycobacterium tuberculosis'e testimiseks mõeldud materjal kogutakse steriilsetesse viaalidesse, millel on tihedalt keeratavad korgid, et vältida keskkonna saastumist ja kaitsta kogutud materjali saastumise eest.

Diagnostilise materjali kogumiseks mõeldud viaalid peavad vastama järgmistele nõuetele:

• peab olema valmistatud löögikindlast materjalist;
• autoklaavimisel peaks kergesti sulama;
• piisava mahuga (40–50 ml):
• omama laia ava röga kogumiseks (läbimõõt vähemalt 30 mm);
• olema kergesti käsitsetav, läbipaistev või poolläbipaistev, et kogutud proovi kogust ja kvaliteeti saaks hinnata kaant avamata.

Optimaalsete uuringutulemuste saamiseks peavad olema täidetud järgmised tingimused:

• materjali kogumine tuleks läbi viia enne keemiaravi algust;
• uuringu materjal tuleb koguda enne hommikul söömist või ravimite võtmist;
• Uuringu jaoks on soovitatav koguda vähemalt 3 hommikust rögaproovi. Röga kogutakse 3 järjestikusel päeval;
• Kogutud materjal tuleb laborisse toimetada nii kiiresti kui võimalik:
• Juhtudel, kui materjali ei ole võimalik laborisse koheselt toimetada, hoitakse seda külmkapis õhutemperatuuril 4 °C mitte kauem kui 48 tundi;
• Materjali transportimisel on vaja pöörata erilist tähelepanu pudelite terviklikkusele.

Õigesti kogutud röga on limase või mukopurulentse iseloomuga. Uuritava röga osa optimaalne maht on 3-5 ml.

Röga kogutakse tervishoiutöötaja järelevalve all. Röga kogumise eest vastutavad isikud peavad tagama teatud reeglite järgimise:

• Patsiendile on vaja selgitada uuringu eesmärki ja vajadust köhida välja mitte sülge ega ninaneelu lima, vaid hingamisteede sügavate osade sisu. Seda saab saavutada produktiivse köha tagajärjel, mis tekib pärast mitut (2-3) sügavat hingetõmmet. Samuti on vaja patsienti hoiatada, et ta peab kõigepealt loputama suud keedetud veega, et eemaldada suuõõnes vegeteeriva mikrofloora põhiosa ja toidujäägid, mis raskendavad röga uurimist;
• Röga kogumisega tegelev meditsiinitöötaja peab lisaks hommikumantlile ja mütsile kandma maski, kummikindaid ja kummist põlle;
• Patsiendi taga seistes on soovitatav hoida pudelit võimalikult huulte lähedal ja köhimisel röga kohe sinna sisse eraldada, samal ajal kui on vaja tagada, et õhuvool oleks suunatud tervishoiutöötajast eemale:
• Kui röga kogumine on lõppenud, peaks tervishoiutöötaja pudeli hoolikalt kaanega sulgema ja hindama kogutud röga kogust ja kvaliteeti. Seejärel pudel märgistatakse ja asetatakse spetsiaalsesse kasti laborisse transportimiseks.

Kui patsiendil röga ei teki, tuleb materjali kogumise päeva eelneval õhtul ja varahommikul anda talle rögalahtistit: vahukommi juureekstrakti (mukaltiini), bromheksiini, ambroksooli jne – või teha ärritavat inhalatsiooni, kasutades ruumis röga kogumiseks paigaldatud seadmeid. Sel viisil kogutud materjali ei säilitata ja seda tuleks kogumispäeval uurida. Laboris selle "tagasilükkamise" vältimiseks tuleks saatekirjale teha vastav märge.

Kui antud asutuses mikrobioloogilisi uuringuid ei tehta, tuleb kogutud diagnostiline materjal laborisse toimetada tsentraalselt, tingimusel, et materjali hoitakse tarnete vahel külmkapis või koos säilitusainetega. Materjal toimetatakse laborisse transpordikastides, mida on lihtne desinfitseerida. Iga proov peab olema varustatud vastava märgistusega ja kogu partiil peab olema täidetud saateleht.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Patsientide läbivaatuse viisid ja sagedus

Tuberkuloosi patsiendi esmase, nn diagnostilise uuringu käigus on vaja uurida vähemalt 3 portsjonit röga, mis on meditsiinipersonali järelevalve all kogutud 2 või 3 päeva jooksul, mis suurendab mikroskoopia efektiivsust.

Tuberkuloosi esmast sõeluuringut peaksid läbi viima kõik tervishoiusüsteemi meditsiini- ja diagnostikaasutused. Hiljuti on esmase uuringu efektiivsuse suurendamiseks kliiniliste diagnostiliste laborite baasil korraldatud nn mikroskoopiakeskused, mis on varustatud kaasaegsete mikroskoopide ja epideemiaohutuse tagamiseks vajalike seadmetega.

Tuberkuloosivastased asutused kasutavad uuringuskeemi, mis näeb ette röga või muu diagnostilise materjali vähemalt 3-kordset uurimist 3 päeva jooksul. Ravi ajal viiakse intensiivse keemiaravi faasis mikrobioloogilisi uuringuid regulaarselt läbi vähemalt üks kord kuus. Jälgimisfaasi üleminekul tehakse uuringuid harvemini - 2-3-kuuliste intervallidega, samas kui uuringute sagedust vähendatakse kahele.

Ekstrapulmonaalse tuberkuloosi diagnostilise materjali kogumise tunnused

Tuberkuloosi ekstrapulmonaalsete vormide patoloogilise materjali tunnuseks on mükobakterite tuberkuloosi madal kontsentratsioon selles, mis nõuab tundlikumaid mikrobioloogiliste uuringute meetodeid, eelkõige toitainekeskkonnale külvamise meetodeid.

Urogenitaaltuberkuloosi korral on uriin uurimiseks kõige kättesaadavam materjal. Uriini kogumist peaks läbi viima spetsiaalselt koolitatud õde.

Välised suguelundid pestakse vee ja seebiga või nõrga kaaliumpermanganaadi lahusega. Kusejuha välist ava töödeldakse hoolikalt. Hommikune uriini keskmine osa kogutakse steriilsesse pudelisse: meestel - loomulikult, naistel - kateetri abil. Neeruvaagna uriin kogutakse steriilsetesse katseklaasidesse ühe või kahe neeru kateetri abil, viimasel juhul - tingimata igast neerust eraldi. Väike kogus seda uriini tsentrifuugitakse ja uuritakse setteid.

Meestel tsentrifuugitakse sette saamiseks spermat, munandipunktsioone ja eesnäärme eritisi. Meeste suguelundite piirkonnas esineva konkreetse protsessi lokaliseerimise korral võib eesnäärme massaaž soodustada tuberkuloosi mükobaktereid sisaldavate eritiste vabanemist.

Menstruaalveri kogutakse naistelt imemise teel või Kafka korgi abil. Saadud materjal vabastatakse erütrotsüütidest destilleeritud veega pesemise ja seejärel tsentrifuugimise teel. Setet uuritakse.

Emakakaela kanalist väljuv eritis kogutakse mõnda anumasse või Kafka korki, see tähendab, et on soovitav koguneda 1-2 ml patoloogilist materjali.

Neerude, suguelundite, biopsiate ja endomeetriumi kraapimise käigus saadud materjal homogeniseeritakse. Selleks asetatakse see steriilsesse uhmrisse ja purustatakse steriilsete kääridega põhjalikult. Saadud suspensioonile lisatakse steriilset jõeliiva koguses, mis võrdub selle massiga, seejärel lisatakse 0,5–1,0 ml isotoonilise naatriumkloriidi lahust ja jahvatatakse kõik, kuni moodustub pudruseline mass, lisades isotoonilise naatriumkloriidi lahuse (4–5 ml). Seejärel lastakse massil 1–1,5 minutit seista ja uuritakse supernatanti.

Luude ja liigeste tuberkuloos. Steriilse süstlaga võetud punktsioon (mädanikest) asetatakse steriilsesse anumasse ja toimetatakse kohe laborisse. Steriilse pipeti abil, mis on eelnevalt niisutatud steriilse isotoonilise naatriumkloriidi lahusega, võetakse 2-5 ml mäda, kantakse see pärlitega pudelisse ja lisatakse veel 2-3 ml isotoonilist naatriumkloriidi lahust. Pudel suletakse korgiga ja loksutatakse loksutil 8-10 minutit. Homogeniseeritud suspensiooni uuritakse.

Osteoartikulaarse tuberkuloosi fistulaarsete vormide korral võetakse fistulist mäda. Rohke eritis kogutakse otse katseklaasi. Vähese mädaerituse korral pestakse fistuli trakti steriilse isotoonilise naatriumkloriidi lahusega ning katseklaasi või mädaga immutatud tampoonitükki kogutud pesuvedelik saadetakse uurimiseks.

Luude ja liigeste kirurgiliste sekkumiste käigus saadud kirurgiline materjal võib koosneda mädase-nekrootilisest massist, granulatsioonidest, armkoest, luukoest, sünoviaalmembraani koest ja muudest substraatidest. Selle töötlemine toimub nagu neerutuberkuloosi puhul.

Kohe pärast punktsiooni tehakse sünoviaalvedeliku mikrobioloogiline uuring 3% naatriumtsitraadi lahuses (suhtes 1:1), et vältida hüübimist.

Lümfisõlmede tuberkuloos. Lümfisõlmede punktsiooni käigus eraldatud mäda uuritakse samamoodi nagu abstsessist pärit mäda. Kirurgiliste sekkumiste ja biopsiate käigus saadud lümfisõlmede kude uuritakse nagu teiste tuberkuloosi vormide puhul.

Mycobacterium tuberculosis'e väljaheidete uuring tehakse äärmiselt harva, kuna positiivsed tulemused puuduvad peaaegu täielikult.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Mükobakterite mikroskoopia

Röga mikroskoopia on suhteliselt kiire, lihtne ja odav meetod, mida tuleks kasutada kõigil tuberkuloosikahtluse juhtudel. Lisaks tehakse seda uuringut keemiaravi efektiivsuse hindamiseks ja taastumise või ravi ebaõnnestumise kinnitamiseks kultuuri tulemuste puudumisel.

Mikroskoopilisel uurimisel kasutatakse kahte meetodit:

• otsene mikroskoopiameetod, kui diagnostilisest materjalist valmistatakse otse määrdproov;
• kultuuriuuringuteks mõeldud dekontamineerivate ainetega töödeldud materjalist valmistatud sette mikroskoopia meetod.

Esimest meetodit kasutatakse nendes laborites, kus tehakse ainult mikroskoopilisi uuringuid (üldise meditsiinivõrgu kliinilise diagnostika laborid).

Mikroskoopilise uuringu parimad tulemused saadakse diagnostilise materjali kontsentreerimisel (näiteks tsentrifuugimise teel).

Mycobacterium tuberculosis'e mikroskoopia abil 50% tõenäosusega tuvastamiseks peab 1 ml röga sisaldama üle 5000 mikroobse raku. Kopsutuberkuloosiga patsientide röga sisaldab tavaliselt märkimisväärsel hulgal happekindlaid baktereid, mis võimaldab neid bakterioskoopia abil usaldusväärselt tuvastada. Selle meetodi diagnostilist tundlikkust saab suurendada, uurides ühelt patsiendilt mitut rögaproovi. Negatiivne bakterioskoopilise uuringu tulemus ei välista tuberkuloosi diagnoosi, kuna mõne patsiendi röga sisaldab vähem mükobaktereid, kui mikroskoopia abil on võimalik tuvastada. Rögapreparaatide halb ettevalmistamine võib samuti olla negatiivse bakterioskoopilise uuringu tulemuse põhjuseks.

Kõige levinum meetod happekindlate mükobakterite tuvastamiseks määrdproovis on Ziehl-Neelseni värvimine. Meetod põhineb karbolfuksiini tungimisel mikroobirakku läbi membraani, mis sisaldab vaha-lipiidikihti, koos kuumutamise ja fenooli tugeva söövitava toime samaaegse mõjuga. Määrdproovi järgnev värvitustamine 25% väävelhappe või 3% vesinikkloriidhappe lahusega viib kõigi mittehappekindlate struktuuride värvitustumiseni. Määrdproovi värvitustunud elemendid värvitakse 0,3% metüleensinise lahusega. Mükobakterid ei taju tavapäraseid aniliinvärve, mille tulemusena värvuvad happekindlad mükobakterid vaarikapunaseks ning teised mikroobid ja rakulised elemendid siniseks.

Ziehl-Neelseni meetodi järgi värvitud määrdproovide uurimiseks kasutatakse immersioonobjektiiviga (90- või 100-kordne suurendus) ja 7- või 10-kordse suurendusega okulaariga valgusbinokulaarset mikroskoopi. Uuritakse 100 vaatevälja, mis on piisav üksikute mükobakterite tuvastamiseks määrdproovis. Kui sellise uuringu tulemus on negatiivne, on kinnituseks soovitatav uurida veel 200 vaatevälja. Tulemused registreeritakse, märkides ära tuvastatud happekindlate mükobakterite (AFB) arvu.

Lisaks sellele meetodile kasutatakse luminestsentsmikroskoopias fluorokroomvärvimist, mis võimaldab saavutada parimaid tulemusi. Selle meetodi kasutamine suurendab mikroskoopia efektiivsust 10–15%. Kui mükobaktereid töödeldakse luminestsentsvärvainetega (auramiin, rodamiin jne), seonduvad need ained ka mikroobiraku vahataoliste struktuuridega. Kui värvitud rakke kiiritatakse erksa valgusallikaga (teatud ultraviolettkiirguse spekter), hakkavad nad mustal või tumerohelisel taustal oranžilt või erkpunaselt helendama. Nähtava pildi suure heleduse ja kontrastsuse tõttu saab mikroskoobi üldist suurendust vähendada 4–10 korda, mis laiendab vaatevälja ja vähendab preparaadi vaatamise aega. Koos sellega saab oluliselt suurema teravussügavuse tõttu suurendada uuringu mugavust.

Fluorestsentsmikroskoopia kasutamisel võtab määrdumisproovi sama piirkonna vaatlemine oluliselt vähem aega kui Ziehl-Neelseni meetodil värvitud määrdumisproovide valgusmikroskoopia. Kui mikroskoopia spetsialist vaatab tööpäeva jooksul umbes 20–25 sellist määrdumisproovi, siis fluorestsentsmikroskoopia abil saab ta sama aja jooksul uurida enam kui 60–80 proovi. Kogenud mikroskoopiaspetsialistid teavad, et rakkude värvimine auramiini ja rodamiini seguga on mingil moel spetsiifiline happekindlate mükobakterite suhtes, millel antud juhul on kuldsete kepikeste välimus. Saprofüüdid värvuvad rohekaks.

Fluorestsentsmikroskoopia meetodi teine oluline eelis on võime tuvastada muutunud mükobaktereid, mis on mitmete ebasoodsate tegurite, eriti intensiivse keemiaravi mõjul kaotanud oma happekindlad omadused ja mida seetõttu Ziehl-Neelseni värvimine ei tuvasta.

Fluorestsentsmikroskoopia meetodi puudusteks on mikroskoobi ja selle käitamise suhteliselt kõrge hind. Tsentraliseeritud või muudes suurtes laborites, kus töökoormus ületab kolme laboritehniku töötamise normi kolme tavapärase mikroskoobiga, on aga odavam kasutada ühte fluorestsentsmikroskoopi.

Bakterioskoopilistel meetoditel on üsna kõrge spetsiifilisus (89-100%). Umbes 97% mis tahes mikroskoopiameetodi abil saadud positiivsetest tulemustest on külvi tulemustega selgelt kinnitatud.

Tuleb märkida, et patoloogilise materjali määrdumise mikroskoopiline uurimine ei võimalda määrata tuvastatud happekindlate mükobakterite liiki. Mikroskoopiline meetod võimaldab teha järelduse ainult happekindlate mikroorganismide olemasolu või puudumise kohta preparaadis, mis on seletatav suure hulga mittetuberkuloossetest happekindlatest mikroorganismidest koosneva loodusega, mis on morfoloogiliselt sarnased tuberkuloosikompleksi mükobakteritega.

Mikroskoopia tulemuste hindamine toimub poolkvantitatiivsetes ühikutes.

Erinevate mikroskoopiameetodite tulemuste võrdlemiseks võetakse kasutusele empiirilised koefitsiendid. Näiteks fluorestsentsvärvidega värvitud määrdumisproovi tulemuste võrdlemiseks valgusmikroskoopia uuringu (1000-kordne suurendus) andmetega on vaja jagada fluorestsentsmikroskoobi abil tuvastatud happekindlate mükobakterite arv vastava koefitsiendiga: mikroskoobi 250-kordse suurenduse korral - 10-ga, 450-kordse suurenduse korral - 4-ga, 630-kordse suurenduse korral - 2-ga.

Mikroskoopia tunnused ekstrapulmonaalse tuberkuloosi korral

Teostatakse otsemikroskoopia, samuti rikastamise järgselt valmistatud määrdproovide mikroskoopia koos järgneva värvimisega Ziehl-Neelseni või fluorestsentsvärvide abil. Määrdproovide otsemikroskoopia on ebaefektiivne materjali mükobakterite madala kontsentratsiooni tõttu ja seetõttu on ratsionaalsem kasutada rikastamismeetodeid. Tsentrifuugimine on kõige efektiivsem. Kui bioloogiline materjal on viskoosne, kasutatakse tsentrifuugimist koos materjali samaaegse homogeniseerimise ja vedeldamisega, mis viiakse läbi kiirete tsentrifuugide abil, mille tsentrifuugimisjõud on 3000 g, ja hüpokloriti lahustega. Teisi rikastamismeetodeid, näiteks mikroflotatsiooni, ei kasutata praegu bioloogiliselt ohtlike aerosoolide tekkimise tõttu.

[ 37 ]

Kultuurimeetod tuberkuloosi diagnoosimiseks

Külvimeetod ehk kultiveerimismeetod on tundlikum kui määrdmikroskoopia ja sellel on viimase ees mitmeid eeliseid. See võimaldab uuritavas materjalis tuvastada mitukümmend elujõulist mükobakterit ja sellel on kõrge diagnostiline väärtus. See on eriti oluline äsja diagnoositud või ravitud patsientidelt saadud materjali uurimisel, kellel eritub väike kogus mükobaktereid.

Võrreldes mikroskoopiaga võimaldab kultuuriuuring suurendada avastatud tuberkuloosihaigete arvu enam kui 15–25% võrra, samuti kontrollida tuberkuloosi varasemas staadiumis, kui haigus on veel kergesti ravitav. Kultuuriuuringu väga oluliseks eeliseks peetakse võimalust saada patogeenikultuuri, mida saab identifitseerida ja uurida seoses ravimitundlikkuse, virulentsuse ja muude bioloogiliste omadustega.

Kasvatusmeetodite puudusteks on nende kestus (materjalide ooteaeg ulatub 10 nädalani), kõrgemad kulud ja diagnostilise materjali töötlemise keerukus.

Diagnostilise materjali külvieelse töötlemise põhimõtted

Tavapäraseid mikrobioloogilisi meetodeid tuberkuloosi testimiseks kasutada ei saa. See on tingitud asjaolust, et tuberkuloosi mükobakterid kasvavad väga aeglaselt ning enamik kliinilisi proove sisaldab kiiresti kasvavaid mädanevaid ja mädanevaid mikroorganisme ja seeni. Nende kiire kasv toitainerikkal keskkonnal takistab mükobakterite arengut ega võimalda tuberkuloosi patogeeni isoleerida, seega tuleb diagnostilist materjali enne külvi eelnevalt töödelda. Lisaks on patsiendi hingamisteedest vabanevad mükobakterid tavaliselt ümbritsetud suure hulga limaga, mis raskendab nende kontsentreerimist. Seetõttu tuleb enne röga ja muude sarnaste materjalide külvi need veeldada ja dekontamineerida.

Kõigil pesuvahenditel ja dekontaminantidel on mükobakteritele enam-vähem väljendunud toksiline mõju. Töötlemise tagajärjel võib kuni 90% mükobakteritest surra. Mükobakterite populatsiooni piisava osa säilitamiseks on vaja kasutada õrnaid töötlusmeetodeid, mis võimaldavad ühelt poolt pärssida kiiresti kasvavaid mädanevaid ja mädanevaid mikroorganisme ning teiselt poolt maksimaalselt säilitada materjalis esinevate mükobakterite elujõulisust.

Sõltuvalt materjalist, selle homogeensusest ja saastumisastmest kasutatakse külvieelseks töötlemiseks mitmesuguseid dekontaminaatoreid: röga puhul - 4% naatriumhüdroksiidi lahus, 10% trinaatriumfosfaadi lahus, bensalkooniumkloriidi trinaatriumfosfaat, NALC-NaOH (N-atsetüül-L-tsüsteiin-naatriumhüdroksiid) NaOH lõppkontsentratsiooniga 1%, uriini ja muude vedelate materjalide puhul - 3% väävelhappe lahus, saastunud proovide, rasva sisaldavate materjalide puhul - oblikhappe lahus kuni 5%. Lisaks kasutatakse mõnel juhul ensüüme ja pindaktiivseid aineid (detergente). Tweeni ja mõnede teiste detergentide kasutamisega kaasneb mükobakteriaalsete rakkude väiksem surm (ellu jääb 40-50%). Neid saab aga kasutada ainult vedelate materjalide puhul. Komplektidena toodetud NALC-NaOH on maailmas enimkasutatav. See meetod võimaldab isoleerida enam kui 85% mükobakteriaalsete rakkude populatsioonist. Kudesid sisaldavate tahkete materjalide dekontaminatsioon on keerulisem, kuna homogeniseerimise ajal on raske arvata materjali hajumise astet. Näiteks lümfisõlmede biopsiate töötlemisega kaasneb sageli suurenenud saastumise sagedus võõrflooraga. Sellisel juhul võib kasutada 1% etooniumi.

Mittehomogeenset materjali homogeniseeritakse klaashelmeste abil dekontamineerivate ainete juuresolekul. Vedelad materjalid eelnevalt tsentrifuugitakse ja töödeldakse ainult setet.

Külvi ja inkubeerimise tehnika

Pärast eeltöötlust materjal tsentrifuugitakse, mille käigus sadestuvad mükobakterid ja suureneb nende sisaldus settekihis ("sette rikastamine"). Saadud settekiht neutraliseeritakse ja külvatakse tihedate toitainekeskkondade või vedela (poolvedela) keskkonnaga katseklaaside pinnale. Ülejäänud settekihist valmistatakse mikroskoopiliseks uurimiseks määrded. Külvitehnika peab vältima diagnostilise materjali ristsaastumist.

Mikrobioloogiliste uuringute tulemuste usaldusväärseks kliiniliseks tõlgendamiseks tuleb järgida järgmist reeglit: mikroskoopilised ja kultuurilised uuringud tuleb läbi viia paralleelselt samast diagnostilise materjali proovist.

Inokuleeritud katseklaasid asetatakse 2 päevaks horisontaalasendisse termostaati temperatuuril 37 ^° C. See tagab materjali ühtlasema imendumise toitainekeskkonda. 2 päeva pärast viiakse katseklaasid vertikaalsesse asendisse ja suletakse hermeetiliselt kummist või silikoonkorkidega, et vältida külvikeskkonna kuivamist.

Põllukultuure hoitakse termostaadis temperatuuril 37 ^° C 10–12 nädalat, kontrollides neid regulaarselt iganädalaselt. Igal kontrollkontrollil registreeritakse järgmised parameetrid:

• visuaalselt vaadeldava kasvu periood külvipäevast alates;
• kasvukiirus (CFU arv);
• kultuuri saastumine võõra mikroobse floora või seentega (sellised katseklaasid eemaldatakse);
• nähtavat kasvu pole. Torud jäetakse termostaati järgmise kontrollini.

Toitainekeskkond

Mükobakterite kultiveerimiseks kasutatakse mitmesuguseid toitekeskkondi: tahkeid, poolvedelaid ja vedelaid. Kuid ühelgi teadaoleval toitekeskkonnal pole omadusi, mis tagaksid kõigi mükobakteriaalsete rakkude kasvu. Sellega seoses on efektiivsuse parandamiseks soovitatav kasutada samaaegselt 2-3 erineva koostisega toitekeskkonda.

Tuberkuloosi patogeeni primaarseks isoleerimiseks ja selle ravimitundlikkuse määramiseks soovitab WHO standardkeskkonnana Lowenstein-Jenseni keskkonda. See on tihe munakeskkond, millel mükobakterite kasv saavutatakse 20.–25. päeval pärast bakterioskoopiliselt positiivse materjali külvamist. Bakterioskoopiliselt negatiivse materjali külvamine nõuab pikemat inkubatsiooniperioodi (kuni 10–12 nädalat).

Meie riigis on laialt levinud ER Finni pakutud Finn-II munakeskkond. See erineb selle poolest, et L-asparagiini asemel kasutatakse naatriumglutamaati, mis käivitab mükobakterites aminohapete sünteesiks teisi teid. Kasv ilmneb sellel keskkonnal mõnevõrra varem ja mükobakterite eraldamise sagedus on 6-8% suurem kui Lowenstein-Jenseni keskkonnas.

Ekstrapulmonaalse tuberkuloosi bakterioloogilise diagnostika efektiivsuse suurendamiseks on soovitatav lisada toitekeskkondade kompleksi modifitseeritud Finn-II söötmeid. Kasvu kiirendamiseks lisatakse Finn-II toitekeskkonda täiendavalt 0,05% naatriumtioglükolaati, mis vähendab hapniku kontsentratsiooni. Mükobakterite ensüümsüsteemide kaitsmiseks lipiidide peroksüdatsiooni toksiliste produktide eest lisatakse Finn-II toitekeskkonda antioksüdanti α-tokoferoolatsetaati kontsentratsiooniga 0,001 μg/ml. Diagnostiline materjal külvatakse standardmeetodi abil.

Venemaa tuberkuloosivastastes laborites kasutatakse ka tihedate toitainekeskkondade teisi modifikatsioone: G. G. Mordovski pakutud toitainekeskkonda "Novaya", V. Anikini väljatöötatud toitainekeskkondi A-6 ja A-9 jne.

Kuna keemiaravi ajal kahjustuvad mikroobiraku mitmesugused ainevahetussüsteemid, kaotab osa mükobakterite populatsioonist võime normaalselt areneda tavapärastel toitainekeskkondadel ja vajab osmootselt tasakaalustatud (poolvedela või vedela) toitainekeskkonda.

Diagnostilise materjali kultuuri tulemuste hindamine ja registreerimine

Mõned mükobakterite tüved ja tüübid kasvavad aeglaselt, kasv võib ilmneda isegi 90. päevaks. Selliste kultuuride arv on väike, kuid see sunnib külve 2,5-3 kuud termostaadis hoidma.

Mycobacterium tuberculosis'e virulentsed kultuurid kasvavad tavaliselt tahketel munasöötmetel R-kujuliste kolooniatena, millel on erinev suurus ja välimus. Kolooniad on kuivad, kortsus, elevandiluu värvi ja kergelt pigmenteerunud. Teistel söötmetel võivad Mycobacterium tuberculosis'e kolooniad olla niiskemad. Pärast keemiaravi kuuri või ravi ajal võib eraldada niiske kasvuga siledaid kolooniaid (S-vormid).

Kultuuride eraldamisel kasutatakse tuberkuloosi mükobakterite eristamiseks mittetuberkuloossetest mükobakteritest ja happekindlatest saprofüütidest spetsiaalsete uuringute komplekti.

Positiivne vastus antakse pärast Ziehl-Neelseni värvimise järgi värvitud kasvanud kolooniate määrdproovi kohustuslikku mikroskoopilist uuringut. Mükobakterite kasvu korral leidub määrdproovides erkpunaseid vardaid, mis paiknevad üksikult või rühmadena, moodustades vildi või punutiste kujulisi kobaraid. Noortes kultuurides, eriti nendes, mis on eraldatud pikka aega keemiaravi saanud patsientidelt, iseloomustab mükobaktereid väljendunud polümorfism, kuni lühikeste, peaaegu kokakujuliste või piklike variantideni, mis meenutavad seeneniidistikku, koos vardakujuliste vormidega.

Mükobakterite kasvu intensiivsus määratakse järgmise skeemi järgi: (+) - 1-20 CFU katseklaasis (madal bakterite eritumine); (++) - 20-100 CFU katseklaasis (mõõdukas bakterite eritumine); (+++) - >100 CFU katseklaasis (rohke bakterite eritumine). Tuberkuloosi laboratoorses diagnostikas ei piisa vastusest, mis näitab, kas konkreetse meetodiga on mükobaktereid avastatud või mitte. Samuti on vaja omada detailset ettekujutust mükobakterite populatsiooni mahust ja olemusest, selle koostisest ja omadustest. Just need andmed võimaldavad protsessi olekut õigesti tõlgendada, taktikat planeerida ja ravi õigeaegselt kohandada.

Viimastel aastatel on mükobakterite kasvu kiirendamiseks pakutud välja agar-põhiseid toitainekeskkondi koos erinevate kasvulisanditega ja spetsiaalse gaasisegu kasutamist. Mükobakterite kasvu saavutamiseks nendel keskkondadel luuakse kultiveerimise ajal suurenenud süsinikdioksiidi sisaldusega (4–7%) atmosfäär. Sel eesmärgil kasutatakse spetsiaalseid CO2 inkubaatoreid _. Suurimat arengut on aga saavutanud automatiseeritud mükobakterite kultiveerimissüsteemid: MGIT-BACTEC-960 ja MB/Bact.

Üks selline süsteem on MGIT (mükobakterite kasvu näitav tuub), mis on kõrgtehnoloogiline arendus ja on loodud tuberkuloosi kiirendatud bakterioloogiliseks diagnostikaks ning mükobakterite tundlikkuse määramiseks esimese ja mõnede teise rea ravimite suhtes. MGIT on mõeldud kasutamiseks VASTEC-960 seadme osana. Mikroorganisme kultiveeritakse spetsiaalsetes katseklaasides vedela toitekeskkonnaga, mis põhineb modifitseeritud Middlebrook-7H9 söötmel. Mükobakterite kasvu stimuleerimiseks ja võõrmikrofloora kasvu pärssimiseks kasutatakse MGIT kasvulisandit ja PANTA antibakteriaalsete ravimite segu.

Mikroorganismide kasvu registreeritakse optiliselt. See põhineb fluorestsentsil, mis tekib siis, kui mükobakterid tarbivad kasvu ajal hapnikku. Spetsiaalse katseklaasi põhjas on hapnikust sõltuv fluorokroomvärvaine, mis on kaetud silikoonkihiga. Mükobakterite paljunemine viib katseklaasis oleva hapniku hulga vähenemiseni ja selle kontsentratsiooni languseni, mis omakorda põhjustab fluorestsentsi suurenemist, mis muutub nähtavaks katseklaasi ultraviolettvalgusega kiiritamisel ja registreeritakse automaatselt VASTES-960 seadmesse sisseehitatud fotosensorite abil. Luminestsentsi intensiivsus registreeritakse kasvuühikutes (GU). Kasvuandmed sisestatakse automaatselt arvutisse, kus neid saab salvestada. Kasvukõverate arvutianalüüs annab teavet erinevate mükobakterite kogumite, sealhulgas mittetuberkuloosse päritoluga bakterite olemasolu kohta ning aitab hinnata ka mükobakterite kasvuomadusi.

Selliste süsteemide kasutuselevõtu tulemusel on mükobakterite kasvuaeg oluliselt lühenenud, keskmiselt 11 päeva VASTEC-960 söötmel ja 19 päeva MB/Bact söötmel, võrreldes 33 päevaga tavalisel tihedal toitekeskkonnal. Tuleb märkida, et need süsteemid nõuavad kõrgelt kvalifitseeritud personali. Materjali külvamisega vedelale söötmele kaasneb tingimata külv Lowenstein-Jenseni söötmele, mis toimib varukeskkonnana juhtudel, kui tuberkuloosi mükobakterid ei kasva muudel söötmetel.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Mükobakterite ravimitundlikkuse määramine

Mükobakterite spektri ja tundlikkuse astme määramine tuberkuloosivastaste ravimite suhtes on kliiniliselt oluline, samuti ravimiresistentse tuberkuloosi leviku epidemioloogiliseks hindamiseks. Lisaks võimaldab ravimiresistentsuse jälgimine hinnata tuberkuloosivastase programmi kui terviku tõhusust, olles lahutamatu näitaja kõigi tuberkuloosivastaste meetmete komponentide toimimisest.

Ravimitundlikkuse testimise sagedus ja ajastus:

• enne ravi alustamist, üks kord ravistrateegia ja taktika kindlaksmääramiseks:
• Patsiendilt erinevatest materjalidest (röga, BAL, uriin, eritised, tserebrospinaalvedelik jne) kultuuride eraldamisel uuritakse kõiki eraldatud tüvesid:
• intensiivse ravifaasi lõpus kliinilise ja radioloogilise dünaamika puudumisel:
• kui on vaja raviskeemi muuta järgmistel juhtudel:
  • röga negatiivsuse puudumine;
  • rekultiveerimine pärast röga negatiivsust;
  • AFB hulga järsk suurenemine määrdumisel pärast esialgset vähenemist. On hästi teada, et tuberkuloosihaige patsiendi materjalist eraldatakse erineva ravimitundlikkusega Mycobacterium tuberculosis tüvesid. Tüvede tundlikkus tuberkuloosivastaste ravimite suhtes võib erineda ravimite spektri, resistentsuse tekke astme, sageduse ja kiiruse poolest.

Mycobacterium tuberculosis'e ravimiresistentsuse aste määratakse kindlaks vastavalt kehtestatud kriteeriumidele, mis keskenduvad resistentsuse kliinilisele olulisusele ja sõltuvad ravimi tuberkuloosivastasest aktiivsusest, selle farmakokineetikast, kontsentratsioonist kahjustuses, maksimaalsest terapeutilisest annusest jne.

Mükobakterite ravimitundlikkuse määramine toimub praegu mikrobioloogiliste meetodite abil:

• absoluutsed kontsentratsioonid (lahjendusmeetod tahkel või vedelal toitainekeskkonnal),
• proportsioonid
• takistuskoefitsient.

Tavaliselt avaldub resistentsus mükobakterite tuberkuloosi kolooniate visuaalselt jälgitava kasvu näol, kuid on olemas meetodeid, mis indutseerivad kasvu mükobakterite rakkude jagunemise algstaadiumis värvireaktsioonide näol. Need meetodid vähendavad testiaega 3-4 nädalalt 2 nädalale.

WHO keemiaravi komitee soovitatud absoluutse kontsentratsiooni meetod on Venemaal laialt levinud ühtse meetodina. Metodoloogilisest vaatepunktist on see kõige lihtsam, kuid nõuab laboratoorsete protseduuride kõrget standardiseerimist ja täpsust. Ravimitundlikkuse test koosneb katseklaaside komplektist, mis sisaldavad tuberkuloosivastaste ravimitega modifitseeritud toitekeskkonda. Komplekt koosneb 2-3 katseklaasist, milles on iga kasutatava ravimi erinevad kontsentratsioonid, ühest kontrollkatseklaasist, milles on ravimit mitte sisaldav keskkond, ja ühest katseklaasist, mis sisaldab 1000 μg/ml naatriumsalitsülaati või 500 μg/ml paranitrobensoehapet mittetuberkuloosse mükobakterite kasvu tuvastamiseks.

Söötmekomplekti koos preparaatidega valmistamiseks kasutatakse modifitseeritud Lowenstein-Jenseni keskkonda (ilma tärkliseta), mis valatakse kolbidesse. Igasse kolbi lisatakse teatud maht vastavat tuberkuloosivastase ravimi lahjendust. Kolbide sisu segatakse hoolikalt, valatakse katseklaasidesse ja hüübitakse kaldus asendis 40 minutit temperatuuril 85 °C. Soovitatav on keskkonda hüübida elektrilises koagulaatoris, millel on automaatne temperatuuri reguleerimine. Söötme tuberkuloosivastaste ravimitega

Esimest rida ravimeid võib hoida külmkapis temperatuuril 2–4 °C 1 kuu, teise rea ravimeid mitte rohkem kui 2 nädalat. Ravimite keskkondade säilitamine toatemperatuuril on vastuvõetamatu. Tuberkuloosivastaste ravimite lahuste valmistamisel võetakse arvesse nende aktiivsust, arvutades kontsentratsiooni, kohandades seda ravimi mittespetsiifilise osa molekulmassi, puhtuse jms suhtes. Ravimitundlikkuse määramiseks kasutatakse ainult keemiliselt puhtaid aineid.

Meetodi põhimõte on määrata tuberkuloosivastase ravimi kontsentratsioon, mis pärsib mükobakterite populatsiooni märkimisväärse osa kasvu. Õigesti teostatuna on sellel meetodil hea usaldusväärsus.

Enne testi tegemist on vaja veenduda, et isoleeritud Mycobacterium tuberculosis kultuur ei sisalda kõrvalist mikrofloorat. Mükobakterite kultuurist 0,9% naatriumkloriidi lahuses valmistatakse homogeenne suspensioon, mis sisaldab 500 miljonit mikroobikeha 1 ml kohta (optilise hägususe standard 5 ühikut). Saadud suspensioon lahjendatakse 0,9% naatriumkloriidi lahusega (1:10) ja lisatakse 0,2 ml suspensiooni igasse toitekeskkonna komplekti katseklaasi. Inokuleeritud katseklaasid asetatakse termostaati temperatuuril 37 °C ja hoitakse horisontaalselt 2-3 päeva, nii et toitekeskkonna kaldus pind oleks ühtlaselt Mycobacterium tuberculosis suspensiooniga inokuleeritud. Seejärel viiakse katseklaasid vertikaalasendisse ja inkubeeritakse 3-4 nädalat. Tulemused registreeritakse 3-4 nädala pärast.

Kuna patogeeni eraldamine kliinilisest materjalist toitainekeskkonnal võtab vähemalt 1–1,5 kuud, saab selle meetodi abil ravimitundlikkuse määramise tulemusi mitte varem kui 2–2,5 kuud pärast materjali külvamist. See on meetodi üks peamisi puudusi.

Mükobakterite ravimtundlikkuse testi tulemusi tõlgendatakse teatud kriteeriumide alusel. Tahke söötme puhul peetakse kultuuri tundlikuks söötmes sisalduva ravimi kontsentratsiooni suhtes, kui antud katseklaasis ravimiga kasvanud mükobakterite kolooniate arv ei ületa 20, samas kui kontrollkatseklaasis ilma ravimiteta on täheldatud rikkalikku kasvu. Ainult siis, kui kolooniaid on rohkem kui 20, loetakse kultuuri antud kontsentratsiooni suhtes resistentseks. Praktikas, kui katseklaasides saadakse kasvutulemuseks ligi 20 CFU, on vaja kliinilist osakonda teavitada, et tundlikkus või resistentsus on antud juhul piiripealne, kuna see võib mõnikord selgitada kliiniliste näitajate ebaselget dünaamikat.

Erinevate preparaatide puhul kehtestatakse teatud kontsentratsioon, mille juures täheldatakse mükobakterite populatsiooni kriitilise osa paljunemist. Neid kontsentratsioone nimetatakse "kriitilisteks". Stabiilsuse kriteeriumina kasutatakse mükobakterite populatsiooni kasvu ulatust toitainekeskkonnas, kus preparaat on kriitilises kontsentratsioonis.

Kodumaises ftisioloogiapraktikas ei piirdu ravimiresistentsuse määramine ainult kriitiliste kontsentratsioonide määramisega. See on tingitud asjaolust, et patogeeni ravimiresistentsuse taseme laiendatud määratlus võimaldab arstil keemiaravi taktikat õigemini formuleerida, kasutades teadmisi ravimikombinatsioonide võimendavast toimest, et ennetada ristresistentsust või kasutada tuberkuloosivastaste ravimite rühmast tõhusamaid ravimeid.

Absoluutse kontsentratsiooni meetod on kõige lihtsam, kuid ka kõige tundlikum selle rakendamisel tehtud vigade suhtes. Usaldusväärsem, eriti teise rea ravimite tundlikkuse määramisel, ja väljaspool Venemaad laialt levinud on proportsioonimeetod. See võtab arvesse absoluutse kontsentratsiooni meetodi puudusi, kuid selle rakendamine on töömahukam.

Meetod on väga sarnane absoluutse kontsentreerimise meetodiga. Katseklaaside ettevalmistamine ravimitega on sama mis absoluutse kontsentreerimise meetodil. Tuberkuloosi mükobakterite suspensiooni külviannust vähendatakse aga 10 korda, mis välistab mõnede tuberkuloosi mükobakterite tüvede spontaanse resistentsuse esinemissageduse selliste ravimite suhtes nagu etambutool, protionamiid, kapreomütsiin. Kontrollidena kasutatakse 2 või 3 katseklaasi, mille külviannus on võrdne katseklaasides oleva annusega ning mida on järjestikku lahjendatud 10 ja 100 korda. Resistentsuse kriteeriumiks on tuberkuloosi mükobakterite visuaalselt vaadeldava kasvu osakaal. Esimese rea ravimite puhul on resistentsuse kriteeriumiks 1% liigne kasv algpopulatsioonist, teise rea ravimite puhul kasv 1 või rohkem kui 10% algpopulatsioonist, olenevalt valitud kriitilisest kontsentratsioonist.

1997. aastal kohandas WHO ja Rahvusvahelise Tuberkuloosivastase Liidu töörühm tuberkuloosivastaste ravimite resistentsuse tuvastamisega seotud kriteeriume, tehes ettepaneku pidada resistentseks mükobaktereid, mis kasvavad tihedal Lowenstein-Jenseni munakeskkonnal järgmistes kontsentratsioonides:

• dihüdrostreptomütsiin - 4 μg/ml;
• isoniasiid - 0,2 µg/ml:
• rifampitsiin - 40 mikrogrammi/ml:
• Etambutool - 2 mikrogrammi/ml.

2001. aastal pakuti välja kriitilised kontsentratsioonid järgmiste teise rea ravimite jaoks (kriitilise osakaalu 1%):

• kapreomütsiin - 40 mcg/ml;
• protionamiid - 40 mcg/ml;
• kanamütsiin - 30 μg/ml;
• viomütsiin - 30 μg/ml;
• tsükloseriin - 40 mcg/ml;
• aminosalitsüülhape - 0,5 mcg/ml;
• ofloksatsiin - 2 mikrogrammi/ml.

Kasvutulemusi hinnatakse esialgselt 4 nädala pärast ja lõplikult 6 nädala pärast.

Pürasiinamiidi, mida tänapäeva tuberkuloosi keemiaravis laialdaselt kasutatakse, ravimiresistentsuse määramiseks on soovitatav kriitiline kontsentratsioon 200 μg/ml. Siiski puudub endiselt üldtunnustatud meetod selle ravimi ravimiresistentsuse määramiseks tahkel toitainekeskkonnal, kuna selle antibakteriaalne toime avaldub ainult happelises keskkonnas (pH <6), mida on tehniliselt raske säilitada. Lisaks ei ole paljud Mycobacterium tuberculosis'e kliinilised kultuurid happelise keskkonnaga munasöötmel kasvamise suhtes vastumeelsed.

Mükobakterite ravimiresistentsuse määramise tulemuste kvaliteedi hindamiseks on soovitatav kontrollida iga uut Lowenstein-Jenseni söötme partiid, määrates paralleelselt standardse muuseumitüve H37Rv tundlikkuse. Lisaks on teatud mikrobioloogilised kriteeriumid, mis peavad olema täidetud, et meetodid annaksid hästi reprodutseeritava ja õigesti tõlgendatava tulemuse. Nende hulka kuuluvad tuberkuloosi mükobakterite kultuuri elujõulisus, homogeense suspensiooni ja suspensiooni saamise reeglid, tuberkuloosi mükobakterite kultuuride valiku reeglid ja valitud bakterimassi representatiivsus. Ravimiresistentsuse määramise usaldusväärsus väheneb äärmiselt halva bakterite eritumise korral.

Hiljuti on automatiseeritud süsteemide abil ravimitundlikkuse määramise meetod tunnistatud paljutõotavaks. Selles valdkonnas on kõige arenenumad VASTEC MGIT-960-l põhinevad arendused. Sel juhul määratakse tuberkuloosi mükobakterite ravimitundlikkus modifitseeritud proportsioonimeetodi abil. Määramise käigus võrreldakse tuberkuloosi mükobakterite kasvukiirust kontrolltuubis ja ravimitega katseklaasides. Streptomütsiini, isoniasiidi, rifampitsiini ja etambutooli suhtes tundlikkuse määramiseks kasutatakse SIRE komplekti kuuluvaid rikastavaid lisandeid ja antibiootikume. Pürasiinamiidi suhtes tundlikkuse määramiseks kasutatakse PZA komplekti. Testi käigus inokuleeritakse ravimitega katseklaasid tuberkuloosi mükobakterite suspensiooniga, samuti kontrolltuubid kõigi ravimite suspensiooni 100-kordse lahjendusega, välja arvatud pürasiinamiid, mille suspensiooni lahjendus on 10-kordne. Stabiilsuse kriteeriumiks on mükobakterite kasvunäitaja 100 GU, kui kasv kontrolltuubis ulatub 400 GU-ni (vt "Mükobakterite eraldamise kultuurimeetodid"). Tulemused salvestatakse ja tõlgendatakse automaatselt ning need määrab sisestatud või valitud programm.

Kriitiliste kontsentratsioonidena kasutatakse katseklaasis vedela toitekeskkonnaga mõõdetud lõppkontsentratsioone. Praegu on kriitilised kontsentratsioonid välja töötatud nii esimese rea ravimite kui ka mõnede teise rea ravimite jaoks. Tuleb märkida, et tuberkuloosi mükobakterite tundlikkuse määramine tsükloseriini ja aminosalitsüülhappe suhtes toimub ainult munatoitekeskkonnal.

Kirjeldatud süsteemiga töötamise detailne protokoll võimaldab ravimitundlikkuse testimist nii isoleeritud kultuuril (tiheda toitekeskkonnaga) kui ka mükobakterite primaarse kasvu abil MGIT katseklaasis. Viimane võimalus vähendab oluliselt kultuuriuuringute läbiviimiseks kuluvat aega, võimaldades tuberkuloosi mükobakterite kultuuri täielikud tulemused (sh teave ravimitundlikkuse kohta) saada 3 nädala jooksul pärast materjali kogumist, samas kui traditsiooniline meetod suudab seda pakkuda alles 3. kuuks. Õigeaegsed tulemused, kui patsient on intensiivse ravi faasis, võivad kompenseerida uuringute suhteliselt kõrget hinda.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Mükobakterite diferentseerumine

Arvestades, et kasutatavad toitainekeskkonnad ei ole rangelt selektiivsed, peetakse isoleeritud mükobakterite järgnevat diferentseerimist kohustuslikuks. Mükobakterite diferentseerimise vajadus tuleneb perekonna esindajate põhjustatud patoloogiliste protsesside mitmetest iseärasustest: tuberkuloosi ja mükobakterioosi erinev kulg ja tulemus, loomuliku ravimiresistentsuse olemasolu mõnede tuberkuloosivastaste ravimite suhtes.

On teada, et M. tuberculosis kompleksi mükobakterite esmane identifitseerimine mittetuberkuloossetest mükobakteritest toimub järgmiste tunnuste alusel: kasvukiirus tihedal toitainekeskkonnal, pigmentide moodustumine, koloonia morfoloogia, happeresistentsuse olemasolu ja kasvuks optimaalne temperatuur.

Kahjuks puudub üine laboratoorne meetod, mis suudaks usaldusväärselt eristada M. tuberculosis kompleksi mükobaktereid teistest happekindlatest mükobakteritest; kuid ülalkirjeldatud tunnuste kombinatsioon allpool toodud mitmete biokeemiliste testide tulemustega võimaldab M. tuberculosis kompleksi mükobaktereid identifitseerida kuni 95% tõenäosusega.

M. tuberculosis kompleksi mükobakterite (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii ja teised) eristamiseks aeglaselt kasvavatest mittetuberkuloossetest mükobakteritest kasutatakse järgmiste tunnuste esinemise tuvastamiseks põhilisi biokeemilisi teste:

• võime toota nikotiinhapet (niatsiinitest):
• nitraatreduktaasi aktiivsus;
• termostabiilne katalaas;
• kasv naatriumsalitsülaadiga (1 mg/ml) söötmel.

Lisakatsena võib kasutada ka kasvukatseid söötmel, mis sisaldab 500 μg/ml paranitrobensoehapet või 5% naatriumkloriidi.

Paljud bakterioloogilised laborid identifitseerivad neid mikroorganisme ainult keerulisel tasandil, mis on tingitud laborite piiratud võimalustest ja spetsialistide metodoloogilistest võimalustest.

Enamasti piisab praktikas M. tuberculosis'e ja M. bovis'e eristamiseks järgmistest testidest: niatsiin, nitraatreduktaas, pürasiinamidaas ja kasvu registreerimine söötmel, mis sisaldab 2 μg/ml tiofeen-2-karboksüülhappe hüdrasiidi. Arvesse võetakse, et M. tuberculosis'e kompleksi mükobaktereid iseloomustavad järgmised tunnused:

• aeglane kasv (rohkem kui 3 nädalat);
• kasvutemperatuur 35–37 ^° C piires;
• pigmentatsiooni puudumine (elevandiluust värvus);
• väljendunud happekindel värvus;
• positiivne niatsiini test;
• positiivne nitraatreduktaasi test;
• termostabiilse katalaasi puudumine (68 ^° C).
• kasvu puudumine Lowenstein-Jenseni söötmel, mis sisaldab:
  • 1000 µg/ml naatriumsalitsüülhapet,
  • 500 mcg/ml paranitrobensoehapet,
  • 5% naatriumkloriidi lahus:
• kasv 1–5 μg/ml tiofeen-2-karboksüülhappe juuresolekul.

Isoleeritud mükobakterite diferentseerimise olulisus suureneb märkimisväärselt tuberkuloosi või mükobakterioosiga seotud HIV/AIDSi juhtude registreerimise sageduse kasvuga. Praegu puudub absoluutne kindlus praktiliste piirkondlike laborite valmisolekus sellise töömahu korrektseks täitmiseks.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Tuberkuloosi immunoloogiline diagnostika

On mitmeid universaalseid nähtusi, preparaate ja immunoloogilisi teste, mis avastati algselt spetsiifiliselt tuberkuloosis või mükobakterite immuunvastuse mudelis. Nende hulka kuuluvad BCG ja tuberkuliin, selline nähtus nagu naha DST (tuberkuliinitestid - Pirquet' ja Mantoux' reaktsioonid), reaktsioon tuberkuliini subkutaansele manustamisele sensibiliseeritud loomadele (Kochi fenomen). Mõned esimesed nakkushaiguste antikehad avastati samuti tuberkuloosis. Loomulikult, mida sügavam on tuberkuloosivastase immuunsuse mehhanismide ja nende geneetilise kontrolli mõistmine, seda laiemalt saab immuunsust mõjutavaid immunoloogilisi meetodeid ja preparaate ftiisioloogia praktiliste probleemide lahendamiseks kasutada.

Praegu peetakse kõige olulisemaks ja keerulisemaks praktiliseks probleemiks tuberkuloosi avastamist elanikkonna massilise sõeluuringu käigus. Vaatamata arvukatele "edu"aruannetele (piiratud materjali põhjal) puudub aga immunoloogiline meetod ("igas käes" reprodutseeritav) ega ravim, mis sobiks nendeks eesmärkideks.

Kliinilises praktikas kasutatakse laialdaselt immunoloogilisi meetodeid, eriti seroloogilisi uuringuid (antigeenide, antikehade määramine) ja tuberkuliini provokatsiooniteste.

Diferentsiaaldiagnostikas kasutatavate immunoloogiliste uuringute seas on esikohal seroloogilised meetodid, mis määravad antigeene ja antikehi keha erinevates keskkondades.

Mükobakterite tuberkuloosi vastaste antikehade määramise spetsiifilisus sõltub immuunanalüüsis kasutatavatest antigeenidest. On välja pakutud märkimisväärne arv antigeene, millest esimene on tuberkuliin PPD:

• PPD ja muud kultuurivedelikust valmistatud komplekspreparaadid;
• ultraheli lagundav aine;
• Tritoni ekstrakt ja muud keerulised rakuseina preparaadid;
• 5-antigeen (Daniel);
• 60-antigeen (Coccito);
• lipoarabinomannaan;
• nöörifaktor (trehaloos-6,6-dimükolaat);
• fenoolsed ja muud glükolipiidid;
• lipopolüsahhariidid;
• fibronektiini siduv antigeen;
• valgud (kõige sagedamini rekombinantsed); 81, 65, 38, 34, 30, 19, 18, 16, 15, 12 KDA jne.

Vene ja välismaiste teadlaste pikaajalise uurimistöö tulemusena on kindlaks tehtud antikehade moodustumise peamised mustrid ja tuberkuloosi seroloogilise diagnostika efektiivsus: mida keerulisem on antigeen, seda suurem on testide tundlikkus ja madalam on spetsiifilisus. Spetsiifilisus varieerub eri riikides sõltuvalt populatsiooni nakatumisest M. tuberculosis'e ja mittetuberkuloosse mükobakteriga, BCG vaktsineerimisest jne. Lastel on serodiagnostika informatiivsus madalam kui täiskasvanutel. Primaarse tuberkuloosi korral (sagedamini lastel) on informatiivsem IgM määramine; sekundaarse tuberkuloosi korral IgG. HIV-positiivsetel inimestel on serodiagnostika informatiivsus antikehade määramisel vähenenud. Antikehade määramise efektiivsus sõltub paljudest "kliinilistest hetkedest": protsessi aktiivsusest (mükobakterite "isolatsiooni" olemasolu või puudumine, mädanenud õõnsuste olemasolu, infiltratsiooni aste), protsessi levimusest, selle kulgu kestusest.

Ensüümimmunoanalüüsi (EIA) meetodi tundlikkus on umbes 70%. Uuringu ebapiisav efektiivsus tuleneb selle madalast spetsiifilisusest. Varem kaaluti seroloogilise sõeluuringu kasutamise võimalusi kõrge riskiga rühmades, eriti inimeste seas, kellel esinevad tuberkuloosijärgsed muutused kopsudes.

ELISA spetsiifilisuse suurendamiseks otsitakse spetsiifilisemaid antigeene, sealhulgas geenitehnoloogia abil saadud antigeene: ESAT-6 jne (vt eespool). Rangelt spetsiifiliste antigeenide (38 kDa, ESAT) kasutamine suurendab spetsiifilisust, kuid vähendab oluliselt analüüsi tundlikkust. Lisaks ELISA-le (eksperimentaalsed laborikatsesüsteemid, näiteks Pathozyme ELISA komplekt) pakutakse ka külgfiltratsiooniga immunokromatograafilisi komplekte (Mycodot) ja teisi sarnaseid teste (membraanipunktanalüüs) koos testi tulemuse visuaalse hindamisega. Nende testide läbiviimisel võtab analüüs aega 10–30 minutit; need ei vaja spetsiaalset varustust, vaid tulemuste visuaalset hindamist, mis on seotud teatud subjektiivsusega. Neil meetoditel on ligikaudu samad tundlikkuse ja spetsiifilisuse omadused (vastavalt 70% ja 90–93%) kui traditsioonilisel ELISA-l.

Immuunanalüüsi meetodite kasutamisel on teatav väärtus täiendava meetodina, mida arvestatakse tuberkuloosi diferentsiaaldiagnostikas kasutatavate meetodite kompleksis, eriti selle ekstrapulmonaalsete vormide diagnoosimisel. ELISA meetod on tuberkuloosse meningiidi diagnoosimisel kõige efektiivsem tserebrospinaalvedeliku uurimisel. Analüüsi tundlikkus on 80-85% ja spetsiifilisus 97-98%. On olemas teavet Mycobacterium tuberculosis'e antikehade määramise efektiivsuse kohta pisaravedelikus tuberkuloosse uveiidi diagnoosimisel.

Gamma-interferooni sünteesi indutseerimine in vitro

Gamma-interferoon (IFN-γ) on spetsiifilise immuunkaitse faktor, mis realiseerub makrofaagide ensüümsüsteemide aktiveerimise kaudu. IFN-γ sünteesi indutseerimine sensibiliseeritud T-lümfotsüütide poolt on põhjustatud nende interaktsioonist mükobakteriaalsete antigeenidega.

Antigeenidena kasutatakse nii tuberkuliini PPD-d kui ka geenitehnoloogia abil saadud spetsiifilisi antigeene, eelkõige ESAT-6 antigeeni (varajane sekreteeritav antigeen molekulmassiga 6 kDa) ja CFP-10 (kultuuri filtraadi valk, 10 kDa). BCG vaktsiini ja teiste mükobakterite rakkudes puuduvad geneetiliselt muundatud või rekombinantsed antigeenid. Tuberkuliini kasutamisel on IFN-γ induktsioonitesti tulemused võrreldavad tuberkuliini nahatesti tulemustega (otsene korrelatsioon). Geneetiliselt muundatud antigeenide kasutamisel on testi tulemused spetsiifilisemad ega sõltu varasemast BCG vaktsineerimisest. Vaktsineeritud isikute uurimisel, kellel ei ole olnud kokkupuudet tuberkuloosiinfektsiooniga, on testi spetsiifilisus 99%. Testi tundlikkus tuberkuloosihaigete seas on vahemikus 81–89%.

Tuberkuloosi mükobakterite antigeenidega in vitro täisvererakkude või verest eraldatud mononukleaarsete rakkude lühiajalisel kultiveerimisel põhinevad testid ja diagnostika, millele järgneb IFN-γ kontsentratsiooni määramine või IFN-γ sünteesivate T-lümfotsüütide arvu loendamine. Katseklaasis sünteesitud interferooni kontsentratsioon määratakse ELISA abil, kasutades IFN-γ-d siduvaid monoklonaalseid antikehi. Seejärel, kasutades standardse IFN-γ kalibreerimist, määratakse selle kontsentratsioon katseklaasis või plaadi süvendites.

Elispoti testis loendatakse IFN-γ sünteesivate T-rakkude arv IFN-γ antikehadega kaetud tassi pinnal.

USA Toidu- ja Ravimiameti poolt heaks kiidetud in vitro IFN-γ induktsioondiagnostika arendajad väidavad, et test ei suuda eristada latentset tuberkuloosiinfektsiooni aktiivsest tuberkuloosist. Seetõttu ei ole testil kõrge nakatumismääraga piirkondades otsest diagnostilist väärtust. Meie riigis saab seda aga kasutada laste tuberkuloosiinfektsiooni eristamiseks vaktsineerimisjärgsest allergiast, samuti spetsiifilise immuunsuse taseme hindamiseks ravi ajal.

Praegu uuritakse kodumaist testimissüsteemi IFN-γ sünteesi indutseerimise määramiseks spetsiifiliste tuberkuloosi antigeenide abil in vitro.

Tuberkuloosi immuunseisund ja kulg, immunokorrektsioon

Tuberkuloosi ravi ajal tekivad inimestel muutused antigeenisisalduses ja immuunsüsteemi seisundis.

Andmed eksudaatide ja kudede muutuste kohta on suures osas vastuolulised. Ainus asi, mida saab täielikult õigustatult märkida, on see, et tuberkuloosse granuloomi hulka kuuluvad reeglina märkimisväärsel hulgal aktiveeritud T-lümfotsüüte.

On mõistlik peatuda veel kahel punktil, mis on vajalikud immunoloogiliste mehhanismide rolli mõistmiseks tuberkuloosi ravis inimestel:

• AIDS-i patsientidel on eriti suur ravimiresistentsuse tekkimise esinemissagedus;
• Mitme ravimi resistentsuse korral (ja HIV-nakkuse puudumisel) on immuunhäired (peamiselt T-rakkude immuunsus) eriti olulised.

Tuberkuloosi korral kasutatakse laialdaselt mitmesuguseid immunokorrektsiooni meetodeid: esiteks on need ravimid, mis toimivad peamiselt T-rakkude immuunsusele ja mononukleaarsele fagotsüütide süsteemile (tüümuse hormoonid, isofon, lükopid, polüoksidoonium jne), samuti tervetele (nõrgestatud) mükobakteritele ja nende komponentidele.

Tuberkuloosi molekulaarbioloogiline diagnostika

Nakkushaiguste diagnostikas kasutatavad molekulaarbioloogilised meetodid hõlmavad peamiselt bakteriaalsete ja viiruslike patogeenide genoomsete materjalide manipuleerimisel põhinevaid meetodeid, et tuvastada spetsiifilist geneetilist materjali - DNA lõike, mille nukleotiidjärjestus on spetsiifiline antud patogeeni liigile või tüvele, analüüsida spetsiifilisi DNA järjestusi geenides, mis määravad patogeeni tundlikkuse teatud ravimite suhtes, samuti analüüsida patogeeni teatud geenide funktsionaalset aktiivsust. Molekulaarbioloogilised meetodid on laialt levinud teadusuuringutes ja praktilises rakenduses erinevate bakteriaalsete ja viirusnakkuste diagnostikas ja jälgimises pärast seda, kui Carrie Mullis (Nobeli preemia laureaat, 1989) avastas polümeraasi ahelreaktsiooni 1985. aastal.

Polümeraasi ahelreaktsiooni meetodi põhimõtted ja võimalused

PCR võimaldab katseklaasis nukleotiidjärjestust (patogeeni DNA fragmenti) mõne tunniga miljoneid kordi amplifikeerida (paljundada). Reaktsiooni läbiviimine üksikute DNA ahelate juuresolekul määrab analüüsi erakordselt kõrge tundlikkuse.

DNA ahela teatud sektsioonide nukleotiidjärjestus määrab mikroorganismi geneetilise ainulaadsuse, mis selgitab PCR-i kõrget spetsiifilisust.

Selle meetodi olulisus Mycobacterium tuberculosis'e omaduste avastamisel ja uurimisel tuleneb mikroorganismi bioloogilistest omadustest, millel on väga aeglane kasv: Mycobacterium tuberculosis'e DNA kahekordistumise aeg nende kultiveerimise ajal on 12–24 tundi.

PCR-meetodi põhimõte on amplifikatsioon - spetsiifilise DNA järjestuse lõikude mitmekordne, miljoneid kordi korrutamine katseklaasi mikromahus järgmiste kolme reaktsioonietapi tsüklilise kordumisega, millest igaüks toimub erinevas temperatuurirežiimis:

• I etapp - kaheahelalise DNA denatureerimine kuumutamisel selle ahelate lahknemisega;
• II etapp - praimerite (praimivate oligonukleotiidide) komplementaarne seondumine (hübridisatsioon) amplifikatsiooniks valitud rangelt spetsiifilise DNA fragmendi ahelate otsasektsioonidega;
• III etapp – DNA fragmendi ahela lõpuleviimine termostabiilse DNA polümeraasi abil.

Amplifikatsiooniks peab katseklaas sisaldama maatriks-DNA molekule. Nelja tüüpi deoksünukleosiidtrifosfaate (nukleotiide), mis sisaldavad vastavaid lämmastikaluseid: adeniin (A), tümiin (T), guaniin (G), tsütosiin (C); kunstlikult sünteesitud praimivad oligonukleotiidid (praimerid), mis koosnevad 18-20 aluspaarist; termostabiilne ensüüm DNA polümeraas, mille temperatuurioptimum on 68-72 ^° C, ja magneesiumioonid.

PCR-i spetsiifilisus sõltub DNA fragmendi valikust. Selle kohaselt sünteesitakse külgnevad praimer-oligonukleotiidid. Hübridisatsiooni ja DNA ahela lõpuleviimise spetsiifilisus määratakse järgmiste lämmastikaluste paaride komplementaarsuse põhimõtte alusel: adeniin-tümiin, guaniin-tsütosiin.

Tuberkuloosikompleksi mükobakterite genoomi määramiseks on enamikus testsüsteemides kõige efektiivsemaks amplifikatsiooni sihtmärgiks IS6110 DNA fragment, millel enamikus tuberkuloosi mükobakterite tüvedes on genoomis märkimisväärne arv (10-20) kordusi, mis tagab lisaks spetsiifilisusele ka analüüsi kõrge tundlikkuse. Samal ajal on kirjeldatud ka tuberkuloosi mükobakterite tüvesid, millel on väike arv kordusi või IS6110 fragmendi puudumine.

DNA molekulide ekstraheerimine bioloogilisest proovist

PCR-i läbiviimiseks tuleb patogeeni DNA molekulid bioloogilisest materjalist eraldada minimaalses mahus, minimaalse koguse mittespetsiifilise DNA ja ensüümi - DNA polümeraasi - erinevate inhibiitoritega.

Proovi ettevalmistamine tuleb läbi viia tingimustes, mis välistavad uuritavate proovide ristsaastumise isoleeritud DNA molekulidega. See nõuab ruumi eelnevat töötlemist ultraviolettvalgusega ning laudade ja seadmete põrandate ja töötasapindade töötlemist kloori sisaldavate lahustega. Samuti on vaja kasutada puhtaid kindaid, ühekordselt kasutatavaid katseklaase ja automaatsete pipettide otsikuid.

Mycobacterium tuberculosis'e DNA eraldamiseks kliinilistest proovidest (tserebrospinaalvedelik, bronhide loputus), mis ei sisalda suures koguses leukotsüüte, rakujääke ega sooli, piisab proovi tsentrifuugimisest kiirusel 3–4 tuhat pööret minutis, settele 20–30 µl 2% Triton X-100 lahust lisamisest ja kuumutamisest temperatuuril 90 ^° C 30 minutit.

Rögaproovi ettevalmistamine nõuab tõhusat veeldamist, tavaliselt kasutatakse 4% naatriumhüdroksiidi ja N-atsetüül-L-tsüsteiini (NALC) annuses 50–80 mg proovi kohta, olenevalt proovi viskoossusest. NALC lahus tuleks valmistada ex tempore või NALC pulbrit võib lisada kuivalt otse proovile. Pärast veeldamist tuleks proove tsentrifuugida 15 minutit kiirusel 3500–4000 p/min (3000 g) 50 ml keeratava korgiga katseklaasides, st samades tingimustes, mida soovitatakse röga ettevalmistamiseks eelkultuurina.

DNA eraldamiseks settest kasutatakse kõige sagedamini meetodit, mis põhineb 5-6 molaarse guanidiinisotiotsüanaadi lahuse kasutamisel lüüsiva reagendina ja mikropoorsete ränioksiidi osakeste ("kobediatomiit") kasutamisel, mis sorbeerivad DNA molekule. Mittespetsiifilised ained, sealhulgas võimalikud inhibiitorid, pestakse seejärel 2,5 molaarses guanidiinisotiotsüanaadi lahuses ja etanoolilahuses, mille järel DNA molekulid desorbeeritakse vees ja neid proove kasutatakse PCR-i läbiviimiseks. DNA ekstraheerimise tehnoloogia lihtsustamiseks asendatakse "kobediatomiit" sageli ränioksiidiga kaetud magnetiliste mikroosakestega. Sel juhul kasutatakse osakeste sadestamiseks tsentrifuugimise asemel spetsiaalset mikrotuubide magnetilist statiivi.

Venemaal on välja töötatud originaalne mükobakterite immunomagnetilise eraldamise meetod koos järgneva patogeeni DNA ekstraheerimisega. Tuberkuloosi mükobakterite immunomagnetiliseks eraldamiseks kasutatakse ränioksiidiga kaetud 3-5 μm suuruseid ferroosakesi, millele keemilise sideme abil kinnitatakse tuberkuloosi mükobakterite vastased polüklonaalsed (jänese) antikehad. Pärast aluselist lüüsi neutraliseeritakse rögaproovid happelise Tris-HCl lahusega ja inkubeeritakse immunomagnetilise sorbendiga. Seejärel kogutakse immunoferroosakesed vahetatava otsaga magnetvarda abil, kantakse mikrotuubi ja sadestatakse. Lisatakse 20-30 μl 2% Triton X-100 lahust ja kuumutatakse 30 minutit temperatuuril 90 ^° C. Supernatanti kasutatakse DNA maatriksina PCR-analüüsis.

Keeruliseks probleemiks on tuberkuloosi mükobakteri DNA eraldamine biopsiaproovidest. Biopsia lüüsimiseks kasutatakse ensüümi proteinaas K lõppkontsentratsioonis 200–500 mg/l temperatuuril 56 ^° C üleöö. Seejärel ekstraheeritakse see ühe tuntud meetodi abil. Liigne mittespetsiifiline DNA biopsiaproovide PCR-analüüsis põhjustab sageli reaktsiooni pärssimist, mis nõuab DNA korduvat ekstraheerimist.

Tulemuste tuvastamise meetodid

Pärast reaktsiooni lõppemist identifitseeritakse patogeeni DNA amplifitseeritud fragmendid erinevate meetodite abil.

Geelelektroforeesi meetod on hästi tuntud. Sel juhul identifitseeritakse saadud DNA fragment positiivse kontrolli abil, mis sisaldab soovitud spetsiifilist DNA fragmenti, või fragmendi eelnevalt teadaoleva suuruse (nukleotiidpaaride arvu) abil, mis määratakse standardse molekulaarse markeri abil.

Spetsiifilise värvaine - etiidiumbromiidi - juuresolekul, mis sisaldub kaheahelalises DNA-s, ilmneb sünteesitud DNA fragment ribana, mis helendab ultraviolettvalguse mõjul.

DNA fragmendi suurus, mis määratakse elektroforeesi teel algusest läbitud vahemaa põhjal, peab vastama teadaolevale molekulmassi markerile või positiivsele kontrollile.

Teised PCR-tulemuste määramise meetodid põhinevad üheahelaliste PCR-produktide hübridiseerimisel komplementaarse oligonukleotiidiga - biotiiniga märgistatud DNA-sondiga, millele järgneb detekteerimine ensümaatilise reaktsiooni abil, näiteks streptavidiini-aluselise fosfataasi konjugaadi sidumisel biotiiniga.

Seda tüüpi tuvastamise põhjal on loodud PCR-analüsaatorid, milles PCR-tulemuste tuvastamine toimub automaatselt proovide optilise tiheduse lugemise tulemusena pärast ensümaatilise reaktsiooni toimumist.

Nende meetodite puudusteks on võimalus laborisiseseks saastumiseks üsna lühikeste DNA molekulide fragmentidega. Kui need molekulid satuvad äsja testitud proovidesse, muutuvad nad PCR-i maatriksiks ja viivad valepositiivsete tulemusteni.

Sellega seoses kehtestatakse valepositiivsete tulemuste vältimiseks ranged reeglid ruumide eraldamiseks ja isoleerimiseks: bioloogilistest proovidest DNA ekstraheerimiseks mõeldud ruumid; tulemuste tuvastamiseks (elektroforees) mõeldud ruumid puhtast tsoonist. Need ruumid kujutavad endast tõenäolise saastumise tsooni. Teine isoleeritud tsoon on puhas ruum uuritavate DNA-proovide viimiseks katseklaasidesse koos PCR-i reaktsiooniseguga. Ja lõpuks eeldatakse, et põhiseade - DNA-võimendi - tuleks viia eraldi, võimalik, et kontoriruumi.

Eelnevate reaktsioonide produktide - amplikonide - saastumise vältimiseks sisaldavad mõned PCR-testsüsteemid deoksünukleosiid-tümidiini asemel deoksünukleosiid-uridiini, mis ehitatakse vastavasse positsiooni in vitro ahelasünteesi käigus, st natiivses DNA-s olev lämmastikalus tümiin asendatakse uratsiiliga. Analüüsitava materjali reaktsioonisegule lisatud uratsiil-DNA glükosülaas hävitab ainult deoksüuridiiniga saastavad fragmendid, kuid mitte deoksütümidiini sisaldavat natiivset analüüsitavat DNA-d. Järgnev kuumutamine temperatuuril 94 ^° C inaktiveerib selle ensüümi ega sega PCR-is amplifikatsiooni.

On olemas rRNA isotermilisel amplifikatsioonil põhinev testsüsteem, mille puhul esmalt teostatakse DNA molekulide pöördtranskriptsioon ja süntees, mis omakorda on maatriks RNA molekulide järgnevale sünteesile. RNA amplikonid tuvastatakse akridiiniga värvitud DNA-sondi abil hübridisatsiooni ajal reaktsioonituubi lahuses. Lisaks kõrgele tundlikkusele on sellel meetodil eeliseks analüüsi läbiviimine ühes katseklaasis, mis hoiab ära saastumise. Autorite sõnul ulatub selle meetodi tundlikkus hingamisteede proovides 90%-ni ja spetsiifilisus 99–100%.

Reaalaja PCR-is rakendatakse uusi tuvastusmeetodeid. Need meetodid erinevad peamiselt selle poolest, et PCR ja selle tulemuste tuvastamine viiakse läbi samaaegselt ühes suletud katseklaasis. See mitte ainult ei lihtsusta tehnoloogiliselt analüüsimeetodit, vaid hoiab ära ka laboriruumide ja proovide saastumise varasema PCR-i produktidega.

Reaalaja PCR-is tuvastatakse tulemused fluorestsentsi abil, mis tekib fluorogeense DNA-sondi hübridisatsioonil PCR-i käigus amplifitseeritud spetsiifilise DNA-fragmendiga. Fluorogeensete DNA-sondide struktuur on konstrueeritud nii, et fluorestsentsmarker vabaneb ensümaatilise reaktsiooni tulemusena või distantseerub fluorestsentsi kustutaja molekulist alles pärast spetsiifilist hübridisatsiooni PCR-i käigus amplifitseeritud soovitud DNA-molekuliga. Sondiga hübridiseerunud molekulide arvu suurenedes on fluorestsentsi suurenemine tuvastatava tasemeni proportsionaalne amplifitseeritud produkti molekulide arvuga. Kuna DNA-fragmentide molekulide arv kahekordistub iga PCR-tsükli jooksul, on tsükli number, millest alates fluorestsents tuvastatakse ja suureneb, pöördvõrdeline DNA-molekulide arvuga algses proovis. Kui reaktsiooni lisatakse kalibraatorina mitu erinevat teadaolevat kontsentratsiooni vastava tuberkuloosi mükobakteri DNA-fragmendi molekule, saab arvutiprogrammi abil arvutada uuritava materjali DNA-genoomide arvu.

Iga standardproovi dubleeritakse. Kvantitatiivne kriteerium on minimaalne PCR-tsüklite arv, mis on vajalik tuvastatava fluorestsentsi tekkimiseks ja kasvuks. Abstsissteljel on tsüklite arv; ordinaatteljel on fluorestsentsi väärtus. DNA kontsentratsioonid on pöördvõrdelised fluorestsentsi ilmnemiseks vajalike tsüklite arvuga. Parempoolses veerus olevad aknad (21–32) näitavad vastavate kontsentratsioonide tsüklite numbreid. DNA fragmentide 10-kordsete kontsentratsioonide 10²–10³ ml erinevused ^on 3,2–3,4 ^tsüklit. Kahel patsiendil olid IS6110 fragmentide kontsentratsioonid umbes 10³ ^/ ml ja 10³ ^/ ml. Võttes arvesse analüüsitud fragmentide korduste arvu (6–20) Mycobacterium tuberculosis'e genoomis, on Mycobacterium tuberculosis'e arv kliinilistes proovides vastavalt umbes 100 ja 1000 rakku.

PCR-i rakendamine tuberkuloosi diagnoosimisel

PCR-meetodit kasutatakse kõige enam tuberkuloosi kiireks diagnoosimiseks - Mycobacterium tuberculosis'e avastamiseks kliinilistes proovides: röga, bronhide loputusvedelik, pleura eritis, uriin, tserebrospinaalvedelik, osteolüüsi punktsioonid, naiste suguelundite aspiraadid ja mitmesugused biopsiad. Hollandis läbi viidud uuringus, milles osales umbes 500 röga- ja bronhide loputusvedeliku proovi 340 patsiendilt, kellel oli kinnitatud kopsutuberkuloosi diagnoos, uuriti PCR-, kultuuri- ja määrdmikroskoopia meetodite võrdlevat tundlikkust. Analüüsi tundlikkus oli vastavalt 92,6, 88,9 ja 52,4%. Kõigi meetodite spetsiifilisus oli umbes 99%.

Mycobacterium tuberculosis'e tuvastamise efektiivsust võrreldi määrdmikroskoopia, külvi Lowenstein-Jenseni söötmele, VASTES testsüsteemi ja PCR analüüsi abil. PCR näitas tundlikkust 74,4%, mikroskoopia tundlikkust 33,8%, külvi tahkele söötmele tundlikkust 48,9% ja VASTES tundlikkust 55,8%. Keskmine tuvastamisaeg külvi korral Lowenstein-Jenseni söötmele on 24 päeva, VASTES tundlikkus 13 päeva ja PCR tundlikkus 1 päev.

Samuti arutatakse PCR-i kasutamise potentsiaali tundliku ja kiire meetodina tuberkuloosiravi efektiivsuse jälgimiseks.

Mycobacterium tuberculosis DNA tuvastamine PCR-meetodil efektiivse keemiaravi korral määratakse pikema aja jooksul - keskmiselt 1,7 kuud võrreldes fluorestsentsmikroskoopia abil määratud bakterite eritumisega ja 2,5 kuud võrreldes bakterioloogilise uuringuga.

Tuberkuloosi ekstrapulmonaalsete vormide diagnoosimine

PCR-i kui tundliku meetodi tähtsus on eriti suur ekstrapulmonaalsete vormide puhul, kuna just nendes vormides on kliinilised ja radioloogilised meetodid ning traditsioonilised bakterioloogilised meetodid Mycobacterium tuberculosis'e määramiseks diagnostilistes materjalides ebaefektiivsed.

Uriiniproovide uurimisel olid PCR-analüüsi tulemused positiivsed 16-l 17-st kuseteede aktiivse tuberkuloosiga patsiendist ja negatiivsed 4-l inaktiivse neerutuberkuloosiga patsiendil ja 39-l kuseteede mittetuberkuloossete haigustega patsiendil.

Näidati PCR-analüüsi efektiivsust luuüdi aspiraatide uurimisel patsientidel, kellel on teadmata tekkepõhjusega palavik ja kahtlustatav haiguse tuberkuloosne iseloom. Tuberkuloosse lümfadeniidi diagnoosimiseks lastel uuriti 102 punktsioonaspiraati ja biopsiaproovi 67 lapselt, kellel kahtlustati tuberkuloosse lümfadeniidi. Positiivsed tulemused saadi: reaalaja PCR-meetodil - 71,6%, fluorestsentsmikroskoopial - 46,3%, kultuuriuuringul - 41,8%. 50 lümfisõlmede biopsia uuringus kassi kriimustushaigusega patsientidel olid kõik tulemused negatiivsed. Seega demonstreeriti PCR-analüüsi 100% spetsiifilisust. Samas töös näidati M. aviumi tuvastamise võimalust lümfisõlmede punktsioonbiopsias.

Naiste suguelundite tuberkuloosi diagnoosimine viljatuse korral on teadaolevalt üks keerulisemaid diagnostilisi probleeme. Endomeetriumi biopsiate, endomeetriumi aspiraatide ja Douglase vedeliku proovide PCR-uuringutes saadi positiivsed tulemused 14-l (56%) 25-st laparoskoopiliselt uuritud patsiendist, kellel kahtlustati tuberkuloosi. Määrdumusmikroskoopia ja kultuuriuuringud andsid vastavalt 1 ja 2 positiivset tulemust. Need juhtumid olid samuti PCR-positiivsed. Enamik PCR-positiivseid tulemusi oli juhtudel, millel histoloogilise uuringu kohaselt esinesid tuberkuloosi iseloomulikud tunnused; väiksem arv oli juhtudel, millel laparoskoopia kohaselt kahtlustati tuberkuloosi. Ainult üks positiivne PCR-tulemus saadi laparoskoopiliste tuberkuloosi andmete puudumisel.

Tuberkuloosi ekstrapulmonaalsete vormide diagnoosimisel tekib arstidel sageli küsimus patogeeni identifitseerimise võimalikkuse kohta vereproovide uurimisel PCR-meetodi abil. Kirjanduse andmed näitavad, et Mycobacterium tuberculosis DNA tuvastamine vereproovidest on võimalik HIV-nakkuse kaugelearenenud vormide korral. Mycobacterium tuberculosis DNA-d tuvastati ainult erinevate organite generaliseerunud tuberkuloosi korral siirdatud neeru ja immunosupressiooniga patsientidel.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Mükobakterite liikide identifitseerimine

PCR-meetod võib olla üsna efektiivne tuberkuloosikompleksi mükobakterite ja mõnede mittetuberkuloosse mükobakteri tüüpide kiireks identifitseerimiseks pärast nende esmase kasvu saamist. Sellisel juhul võib PCR-i kasutamine säästa 7-10 päeva, mis on vajalik positiivse tulemuse järgnevaks kultuuriliseks identifitseerimiseks. PCR-uuring on tehniliselt väga lihtne, kuna see ei nõua kliinilise materjali keerukat proovi ettevalmistamist kõrge tundlikkuse saavutamiseks. 80 positiivse kultuuri uurimisel sellises testsüsteemis (MB BacT. by Organon) olid kõik positiivsed PCR-analüüsi tulemused rangelt spetsiifilised ja viidi läbi 1 päeva jooksul. Teiste mükobakterite tüüpide identifitseerimiseks kultuuris hübridiseeritakse patogeeni DNA spetsiifiliste akridiiniga märgistatud DNA-sondidega ja tüved tuvastatakse kemoluminestsentsi ilmnemise järgi, kasutades kemoluminomeetrit või nitrotselluloosribadel, hinnates pärast hübridiseerimist visuaalselt. See komplekt identifitseerib piiratud arvu liike: Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. avium complex, M. kansasii ja M. gordonae.

A. Telenti jt. töötasid välja ka suhteliselt lihtsa ja odava meetodi kliiniliselt oluliste mükobakterite liikide identifitseerimiseks, mis põhineb PCR-il ja sellele järgneval töötlemisel kahe restriktsiooniensüümiga (ensüümid, millel on võime lõigata DNA molekuli kindlates punktides). Sel juhul amplifitseeritakse kuumašoki valku kodeeriv DNA fragment (65 kDa), mille järel PCR-is saadud 439 nukleotiidipaari pikkust DNA fragmenti töödeldakse eraldi kahe ensüümiga - Bste II ja Нае III. Seejärel analüüsitakse agaroosgeelelektroforeesi abil kahte saadud produkti, määrates nende suurused (nukleotiidipaaride arv), kasutades standardsete DNA fragmentide (molekulaarsete DNA markerite) komplekti pikkusega 100 kuni 1000 nukleotiidipaari. Igas määratletud liigis (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) leitakse iga restriktsiooniensüümi kohta 2 või 3 erineva suurusega DNA fragmenti. Saadud erineva suurusega DNA fragmentide kombinatsioon võimaldab neid liike üksteisest eristada.

Arendamisel on bioloogiliste DNA mikrokiipide tehnoloogia, mis aitab ühe uuringuga tuvastada enam kui 100 mükobakterite liiki.

Liikide identifitseerimist saab läbi viia ka 16S rRNA varieeruva piirkonna PCR-amplifikatsiooni abil, millele järgneb amplikonide sekveneerimine võrreldes vastava primaarstruktuuriga, mis võimaldab identifitseerida enam kui 40 mükobakterite liiki.

PCR-i saab kasutada ka tuberkuloosi mükobakterite kompleksi liikide tuvastamiseks, sealhulgas M. bovise ja M. bovis BCG eristamiseks. Seda tehakse teatud geenide olemasolu või puudumise analüüsimise teel genoomsetes piirkondades RD1, RD9 ja RD10. RD1 puudub M. bovis BCG-s, kuid esineb virulentsetes liikides, sealhulgas M. bovises.

Mycobacterium tuberculosis'e ravimitundlikkuse määramine PCR-meetodil

Molekulaargeneetiliste meetodite ülesanded Mycobacterium tuberculosis'e ravimitundlikkuse või resistentsuse määramiseks taanduvad mutatsioonide tuvastamisele teadaolevate geenide teatud nukleotiidjärjestustes. Peamised meetodid põhinevad kas nende järjestuste otsesel lugemisel (sekveneerimisel) pärast amplifikatsiooni või PCR-i käigus amplifitseeritud biotiiniga märgistatud DNA fragmentide hübridiseerimisel DNA-sondidega. Mõlemad võimalused hõlmavad nukleotiidjärjestuste asenduste tuvastamist, mis DNA-sondide kasutamisel viivad ensüümikonjugaati (streptavidiin-aluseline fosfataas) kasutades nitrotselluloosmembraanil hübridisatsiooni puudumiseni või mittetäielikule toimumisele - LIPA-Rif-TB meetod.

Meetodit, mille abil mõõdetakse lokaalselt fikseeritud DNA-sondides fluorestsentsi mikropiirkondades, mis on komplementaarsed teadaolevate mutatsioonidega PCR-amplifitseeritud geenipiirkondades, mis vastutavad ravimitundlikkuse või -resistentsuse eest, nimetatakse mikrobiokiipide meetodiks. Selle uuringu läbiviimise põhialgoritm on järgmine. Pärast DNA eraldamist kliinilisest proovist või mükobakterite kultuurist tuleb läbi viia PCR, et amplifitseerida vastavad groB geeni fragmendid, mis vastutavad ravimitundlikkuse eest rifampitsiini suhtes, või katG ja inhA geenid, mis kodeerivad mükobakteriaalseid valke, mis vastutavad tundlikkuse eest isoniasiidi suhtes. PCR-i tulemusi hinnatakse agaroosgeelelektroforeesi abil, mis kinnitab soovitud pikkusega vastavate DNA fragmentide saamist. Seejärel viiakse läbi teine PCR-voor, et viia DNA-sse fluorestsentsmärgis. PCR-i tulemusi kinnitatakse uuesti geelelektroforeesiga. Pärast seda viiakse läbi hübridisatsioon (inkubatsioon üleöö) koos saadud materjali järgneva pesemisega biokiibile, mis on suur hulk lühikesi DNA-ahelaid (sonde), mis on fikseeritud väikesele klaasplaadile ja mis on komplementaarsed ravimitundliku tuberkuloosi mükobakterite tüübi nukleotiidjärjestustega võimalike mutatsioonide punktides. samuti ravimresistentsuse eest vastutavate mutantjärjestuste suhtes. DNA-sondide asukoht plaadil on rangelt määratletud ja spetsiaalse lugemisseadme abil tulemuse määramiseks määratakse hübridisatsiooni ajal täheldatud fluorestsentsi tase. Sellega seoses määratakse analüüsi tulemused spetsiaalse arvutiprogrammi abil.

Viimastel aastatel on reaalajas PCR-tehnoloogial põhinevad alternatiivsed meetodid Mycobacterium tuberculosis'e ravimitundlikkuse määramiseks, mis võimaldab neid uuringuid läbi viia suletud katseklaasis.

Joonis 13-13 näitab Mycobacterium tuberculosis'e kliiniliste kultuuride analüüsi tulemusi rifampitsiiniresistentsuse määramisel reaalaja PCR-i abil: 218 - kontrollproov (rifampitsiini suhtes tundlik); 93 - Ser-Trp TCG-TGG mutatsiooni positiivne kontroll; 4482 - Ser-Leu TCG-TTG mutatsiooni positiivne kontroll; 162-322 - eksperimentaalsed proovid. 4 kanali amplifikatsiooni kineetiliste kõverate arvutamise tulemus: kanal 1: 393 - Ser-Trp TCG-TGG mutatsiooni positiivne kontroll; kanal 2: 4482 - Ser-Leu TCG-TTG mutatsiooni positiivne kontroll; 162, 163, 172, 295 - eksperimentaalsed proovid; kanal 4: kõigi katses osalenud proovide amplifikatsiooni kineetilised kõverad. Amplifikatsioonireaktsiooni positiivne kontroll. Järeldused: Analüüs näitas järgmisi rifampitsiiniresistentsust määravaid mutatsioone: proovides 162, 163, 172, 295 - Ser-Leu TCG-TTG. Sama põhimõtet kasutati isoniasiidi ravimiresistentsuse määramiseks katG ja inhA geenide abil, mis määravad kõige sagedasemad mutatsioonid.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Mycobacterium tuberculosis'e tüve identifitseerimine

Mycobacterium tuberculosis'e tüve identifitseerimise enim uuritud meetod on tehnoloogia, mida nimetatakse restriktsioonifragmendi pikkuse polümorfismiks (RFLP) ja mis põhineb Mycobacterium tuberculosis'e DNA fragmenteerimisel (restriktsioonil) ensüümi Pvu II abil ja saadud fragmentide järgneval hübridiseerimisel teatud spetsiifiliste järjestustega selle korduselemendi IS6110 DNA-l. Liigisisene varieeruvus tuleneb IS6110 korduste erinevast arvust ja nende asukohast DNA-l, samuti restriktsiooniensüümi teatud rünnakupunktide (restriktsioonisaitide) ja IS6110 elemendi vaheliste vahemaade mitmekesisusest. See tehnoloogia on väga keeruline ja töömahukas. Pärast tuberkuloosi mükobakterite kultuurist eraldatud DNA töötlemist restriktsiooniensüümiga teostatakse geelelektroforees, seejärel kantakse erineva pikkusega DNA fragmendid nitrotselluloosmembraanile, hübridiseeritakse IS6110 elemendi fragmentidega ja tulemused tuvastatakse ensümaatilise reaktsiooni abil. Saadud spetsiifiline ribade muster iseloomustab spetsiifilise tuberkuloosi mükobakterite tüve DNA-d. Arvutianalüüs näitab tüvede identsust või sugulust. Hoolimata asjaolust, et RFLP meetod on kõige diskrimineerivam, st see paljastab analüüsitud tüvede seas suurima hulga erinevusi, on see ebaefektiivne väikese arvu (alla 5) IS6110 korduste korral, mida on täheldatud mõnedel tüvedel. Joonistel 13-14 on näidatud tüvede RFLP tüpiseerimise tulemused.

Alternatiiviks võib olla spoligotüüpimise meetod - DNA vahejärjestuste polümorfismi analüüs - DR-piirkonna otseste korduste vaheline vahejärjestus. Tüvede spoligotüüpimisel viiakse PCR läbi DR-piirkonda piiravate praimeritega, mille järel moodustuvad erineva pikkusega fragmendid, mis hübridiseeruvad varieeruvate DNA vahepiirkondadega. DR-piirkonna vahejärjestuste analüüs tundub teadlaste sõnul lihtsam, produktiivsem ja sobivam tüvede esmaseks skriinimiseks ja esialgseks epidemioloogiliseks analüüsiks, samuti kliinilise materjali otseseks uurimiseks.

Ilmselgelt on efektiivsem ja tehnoloogiliselt kättesaadavam meetod VNTR (ingliskeelsete sõnade lühend) ehk meetod mükobakteri tuberkuloosi DNA-s esinevate täpsete tandemkorduste muutuva arvu määramiseks. See meetod põhineb ainult PCR-i kasutamisel ega vaja täiendavaid manipulatsioone. Kuna tandemkorduste arv erinevates tüvedes ja erinevates lookustes on erinev, määratakse ja analüüsitakse PCR-produktide saadud elektroforogrammil erineva suurusega fragmente. Teadlaste sõnul saavutatakse VNTR-i abil tüvede suurem eristamise aste kui RFLP-meetodil.

Viimastel aastatel on palju tähelepanu pööratud W-Beijingi perekonna Mycobacterium tuberculosis'e tüvede (mida mõnikord nimetatakse ka Pekingi tüveks) levikule, mis on suures osas ravimiresistentsed.

Molekulaarbioloogiliste uuringute kvaliteedi põhinõuded

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

PCR-i läbiviimise peamised regulatiivsed dokumendid

Venemaa Föderatsiooni Tervishoiuministeeriumi korraldused: nr 45, 7.02.2000; nr 109, 21.03.2003; nr 64, 21.02.2000. Juhised: 1.3.1888-04 "Töökorraldus III-IV patogeensusrühma patogeensete bioloogiliste ainetega nakatunud materjali PCR-uuringute ajal"; 1.3.1794-03 "Töökorraldus I-II patogeensusrühma mikroorganismidega nakatunud materjali PCR-uuringute ajal". 2003; 3.5.5.1034-01 "I-IV patogeensusrühma bakteritega nakatunud uuritava materjali desinfitseerimine PCR-meetodil töötamisel", 2001. Lisa 11 juhendile tuberkuloosi avastamisel, diagnoosimisel ja ravimisel kasutatavate mikrobioloogiliste uuringute ühtsete meetodite kohta.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Personal

Molekulaarbioloogilisi uuringuid võivad läbi viia kliinilise labori diagnostika arstid, bakterioloogid, viroloogid, kliinilise diagnostika labori bioloogid, samuti keskharidusega spetsialistid, kes on läbinud spetsialiseerumise ja täiendkoolituse kehtestatud korras.

Laboriruumide paigutus

Vajalikud on järgmised laboriseadmed:

• Proovide töötlemisala - labor, mis on kohandatud töötama patogeensusrühmade III-IV nakkustekitajatega vastavalt metoodilistele juhistele 13.1888-04.
• PCR-reaktsioonisegude ettevalmistamise ala on laboriruum, mis pakub kaitset sisemise laborisaaste eest – „puhas“ ala.
• • Kui PCR-produktide analüüsimiseks kasutatakse elektroforeesi või hübridisatsiooni, peab laboriruum, kus amplifitseeritud DNA fragmendid amplifikatsioonituubist ekstraheeritakse ja vastavalt PCR-laborite nõuetele (metoodilised juhised 1.3.1794-03, metoodilised juhised 1.3.1888-04) keskkonda sattuvad, olema eelmistes lõikudes nimetatud ruumidest täielikult isoleeritud. Personali, seadmete, materjalide ja esemete liikumine elektroforeesi alalt proovi töötlemisalale ja „puhtale“ alale, samuti õhu liikumine ventilatsioonisüsteemi kaudu või tuuletõmbuse tõttu tuleb välistada. See ala ei ole PCR-produktide fluorimeetriliseks tuvastamiseks vajalik.
• Tulemuste dokumenteerimise ja töötlemise ruum on varustatud arvutite ja vajaliku kontorivarustusega. Selles ruumis võivad olla seadmed, mis tagavad PCR-produktide tuvastamise ilma katseklaasi avamata. - fluorestsents-PCR-detektorid ja termotsüklerid reaalajas PCR-i jaoks.

Röga esmase töötlemise sanitaar- ja epidemioloogilised nõuded on sarnased Mycobacterium tuberculosis'ega töötamise standardsete mikrobioloogiliste nõuetega.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

PCR-diagnostika laboriseadmete täielik komplekt

Laborikomplekt sisaldab seadmeid järgmiste ruumide jaoks.

• Proovide ettevalmistusruum, mis sisaldab järgmist varustust: II kaitseklassi "SP-1.2" laminaarvoolukapp: Eppendorfi katseklaaside jaoks mõeldud tahkistermostaat soojendusega kaanega; mikrotsentrifuug kiirusel 13 000 p/min; tsentrifuug ("Vortex"); külmkapp temperatuurivahemikuga -20 ^° C kuni +10 ^° C; "Proline" seeria muudetava mahuga pipetid; pump püüniskolviga OM-1; pipetialus; tööjaamaalus 200x0,5 ml; tööjaamaalus 50x1,5 ml; alused katseklaaside hoidmiseks 80x1,5 ml;
• reaktsioonisegu ettevalmistusruum: kaitsekamber PCR-karbile ("Laminar-C. 110 cm); tsentrifuug "Vortex"; muutuva mahuga pipetid seeriast "Proline"; pipetialus; tööjaamaalus 200x0,2 ml; alused katseklaaside hoidmiseks 80x1,5 ml; külmkapp temperatuurivahemikuga -20 ^° C kuni +10 ^° C;
• Elektroforeesiruum: horisontaalne elektroforeesikamber; toiteallikas; transilluminaator;
• DNA võimendi või nukleiinhapete analüsaator (reaalaja PCR) koos arvuti ja tarkvaraga; saab paigutada mis tahes vabasse ruumi. Reaalaja PCR tehnoloogia kasutamisel pole elektroforeesiruumi vaja.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Väline kvaliteedikontroll

Objektiivselt usaldusväärsete tulemuste saamiseks peavad laborid osalema laboriuuringute kvaliteedi välise hindamise süsteemis.

Kvaliteedikontrollisüsteemis osalejad saavad: 12 ampulli bakterirakkude lüofiliseeritud suspensioonidega, millest kaks sisaldavad E. coli, 3 ampulli tuberkuloosi mükobakteritega (avirulentne tüvi) kontsentratsioonis 102 ^/ ml; 3 ampulli sarnase tüve rakkudega kontsentratsioonis 104 ^/ ml; 2 ampulli mittetuberkuloosse mükobakteriga M. avium-intracellulare ja M. kansasii kontsentratsioonis 105 ^/ ml.

Väliseks kvaliteedihindamiseks saadetud testid on eelnevalt testitud kahes sõltumatus laboris, millel on selles valdkonnas ulatuslikud kogemused.

[ 85 ], [ 86 ]