Tüvirakud ja taastav plastiline meditsiin

Tänapäeval on vähe praktiseerivaid arste, kes ei tea uue suuna arengust kõige raskemate haiguste ravis, mida traditsiooniline ja alternatiivmeditsiin varem ravimatuks pidas. Me räägime regeneratiiv-plastilisest meditsiinist, mis põhineb tüvirakkude regeneratiivse potentsiaali kasutamisel. Arengusuuna ümber on tekkinud enneolematu teaduslik arutelu ja pseudoteaduslik hüpe, mis on suuresti loodud tänu veebi infohüperboolidele. Väga lühikese aja jooksul on tüvirakkude terapeutiliste võimete laboratoorsed uuringud ületanud katseid ja neid on hakatud aktiivselt rakendama praktilises meditsiinis, mis on tekitanud hulga teaduslikke, eetilisi, religioosseid, õiguslikke ja seadusandlikke probleeme. Riigi- ja avalik-õiguslikud asutused on osutunud selgelt ettevalmistamata tüvirakkude Petri tassidelt intravenoosse manustamise süsteemidele ülemineku kiiruseks, mis ei ole kasulik ei ühiskonnale tervikuna ega konkreetsele kannatavale inimesele. Tüvirakkude võimete kohta käiva kujuteldamatu hulga teabe mõistmine nii kvantiteedi kui ka kvaliteedi osas pole lihtne isegi spetsialistidel (keda pole, kuna kõik püüavad uut teadussuunda iseseisvalt omandada), rääkimata arstidest, kes ei tegele otseselt regeneratiivse plastilise meditsiiniga.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Miks selliseid katseid vaja on ja kas neid üldse vaja on?

Esmapilgul tundub rakkudevaheliste liikidevaheliste kimääride loomine bioeetika unustanud fanaatilise teadlase ohjeldamatu fantaasia vili. Kuid just see lähenemisviis on oluliselt laiendanud meie fundamentaalseid teadmisi embrüogeneesist, kuna see on võimaldanud arvutada organogeneesiks (maksa, aju, naha ja immuunsüsteemi organite moodustumiseks) vajalike rakkude arvu. Lisaks (võib-olla on see ESC bioloogias peamine asi) on geneetikud saanud enda käsutusse ainulaadse tööriista, mille abil saab embrüote kimäriseerimise ajal kindlaks teha geenide funktsionaalset eesmärki. Esmalt kasutatakse spetsiaalset topeltväljalülitustehnikat, et uuritud geenipaar ESC-des "välja lülitada". Seejärel viiakse sellised ESC-d blastotsüsti ja jälgitakse areneva kimäärse embrüo kehas toimuvaid muutusi. Sel viisil määrati kindlaks geenide sf-1 (neerupealise ja suguelundite areng), urt-l (neeru anlage), muoD (skeletilihaste areng) ja gata-l-4 (erütropoeesi ja lümfopoeesi anlage) funktsioonid. Lisaks saab kimäärse embrüo abil laboriloomade ESC-desse viia (transfekteerida) seni uurimata inimese geene, et määrata nende funktsiooni.

Kuid reeglina ei leia eksperimendi õigustamine uute fundamentaalsete teadmiste omandamisega laia publiku toetust. Toome näite kimääriseerimise rakenduslikust tähtsusest ESC-de abil. Esiteks on see ksenotransplantatsioon ehk loomaorganite siirdamine inimestele. Teoreetiliselt võimaldab inimese-sea rakkude kimääride loomine saada looma, kelle antigeensed omadused on ESC doonorile palju lähedasemad, mis erinevates kliinilistes olukordades (diabeet, maksatsirroos) võib päästa haige inimese elu. Tõsi, selleks peame kõigepealt õppima, kuidas tagastada totipotentsuse omadus küpse somaatiliste rakkude genoomi, misjärel saab selle viia arenevasse seaembrüosse.

Tänapäeval kasutatakse ESC-de võimet spetsiaalsetes kultiveerimistingimustes peaaegu lõpmatult jaguneda totipotentse rakumassi tootmiseks koos selle järgneva diferentseerumisega spetsialiseerunud rakkudeks, näiteks dopamiinergilisteks neuroniteks, mis seejärel siirdatakse Parkinsoni tõvega patsiendile. Sellisel juhul eelneb siirdamisele tingimata saadud rakumassi sihipärane diferentseerumine spetsialiseerunud rakkudeks, mis on vajalikud töötlemiseks, ja viimaste puhastamine diferentseerumata rakulistest elementidest.

Nagu hiljem selgus, polnud kartsinogeneesi oht kaugeltki ainus takistus rakkude siirdamisele. Spontaanselt diferentseeruvad embrüokehades olevad ESC-d heterogeenselt, st moodustavad derivaate väga erinevatest rakuliinidest (neuronid, keratinotsüüdid, fibroblastid, endoteliotsüüdid). Mikroskoobi vaateväljas paistavad kardiomüotsüüdid sel juhul silma erinevate fenotüüpidega rakkude seas, millest igaüks tõmbub kokku omas rütmis. Patsiendi ravimiseks on aga vaja puhtaid rakupopulatsioone: neuronid - insuldi korral, kardiomüotsüüdid - müokardiinfarkti korral, kõhunäärme β-rakud - suhkurtõve korral, keratinotsüüdid - põletuste korral jne.

Rakusiirdamise arengu järgmine etapp oli seotud tehnoloogiate väljatöötamisega piisava arvu (miljonite rakkude) selliste puhaste rakupopulatsioonide saamiseks. ESC-de suunatud diferentseerumist põhjustavate tegurite otsing oli empiiriline, kuna nende sünteesi järjestus embrüogeneesi ajal jäi teadmata. Algselt tehti kindlaks, et munakollase moodustumist indutseeritakse cAMP ja retinoehappe lisamisega ESC kultuurile. Hematopoeetilised rakuliinid moodustati 1L-3, SCF, fibroblastide kasvufaktori (FGH), insuliinilaadse kasvufaktori (IGF-1), 1L-6 ja granulotsüütide kolooniat stimuleeriva faktori (G-СSF) juuresolekul kultuurikeskkonnas. Närvisüsteemi rakud moodustati ESC-dest pärast LIF-i ja fibroblastide kihi eemaldamist, mis toimis toitjana. Pärast töötlemist retinoehappega looteseerumi juuresolekul hakkasid ESC-d diferentseeruma neuroniteks ja kardiomüotsüüdid saadi dimetüülsulfoksiidi (DMSO) lisamisega, mis tagab hüdrofoobsete signaalimolekulide sihipärase kohaletoimetamise rakutuuma. Sel juhul aitasid aktiivsete hapnikuühendite kogunemine kultuurikeskkonnas ja elektriline stimulatsioon kaasa küpsete kontraktiilsete kardiomüotsüütide moodustumisele.

ESC-de diferentseerumise tingimuste leidmiseks kõhunäärme insuliini tootvateks rakkudeks kulutati tohutult pingutusi ja ressursse. Peagi selgus aga, et mitmed spetsialiseerunud rakuliinid (kõhunäärme β-rakud, immuun- ja endokriinrakud, adipotsüüdid) ei teki ESC-dest, kui neid stimuleerida põhimõttel „üks stimuleeriv faktor – üks rakuliin“. See põhimõte osutus kehtivaks ainult piiratud arvu rakuliinide puhul. Eelkõige saab neuronite moodustumist indutseerida retinoehappega, lihasrakkude liinil transformeeriva kasvufaktori β (TCP-β) abil, erütroidrakkude liinidel 1L-6 ja monotsüüt-müeloidrakkude liinil 1L-3. Lisaks osutus nende faktorite mõju ESC-de diferentseerumisele rangelt doosist sõltuvaks.

Algas etapp, kus otsiti kasvufaktorite kombinatsioone, mis viiksid ESC-d embrüogeneesi hilisematesse etappidesse koos mesodermi (kardiomüotsüütide, skeletilihaste, neerutuubulite epiteeli, müeloerütropoeesi ja silelihasrakkude allikas), ektodermi (epidermis, neuronid, võrkkest) ja endodermi (peensoole epiteel ja sekretoorsed näärmed, pneumotsüüdid) moodustumisega. Loodus justkui sundis teadlasi embrüogeneesi teel edasi liikuma, korrates selle etappe Petri tassis, andmata võimalust soovitud tulemust kohe ja lihtsalt saavutada. Ja sellised kasvufaktorite kombinatsioonid leitigi. Aktiviin A koos TGF-β-ga osutus ESC-dest mesodermaalsete rakkude moodustumise võimsaks stimulaatoriks, blokeerides samal ajal endodermi ja ektodermi arengut. Retinoehape ja luuüdi morfogeneetilise valgu (BMP-4) ning epidermaalse kasvufaktori (EGF) signaalide kombinatsioon aktiveerivad ekto- ja mesodermirakkude moodustumist, peatades endodermi arengu. Kõigi kolme idukihi intensiivset rakkude kasvu täheldatakse kahe teguri samaaegse mõjuga ESC-dele - hepatotsüütide kasvufaktor (HGF) ja närvirakkude kasvufaktor.

Seega on vajalike rakuliinide saamiseks vaja esmalt embrüonaalsed tüvirakud üle kanda mingisuguse idukihi rakkude moodustumise staadiumisse ja seejärel valida uus kasvufaktorite kombinatsioon, mis on võimeline indutseerima ekto-, meso- ja endodermi suunatud diferentseerumist spetsialiseeritud rakkudeks, mis on patsiendile siirdamiseks vajalikud. Kasvufaktorite kombinatsioonide arv on tänapäeval tuhandetes, enamik neist on patenteeritud, mõnda biotehnoloogiaettevõtted üldse ei avalikusta.

Oli aeg puhastada saadud rakud diferentseerumata rakulistest lisanditest. Kultuuris diferentseerunud rakud märgistati küpsete rakuliinide markeritega ja lasti läbi kiire laserimmunofenotüübilise sorteerija. Laserkiir leidis need üldisest rakuvoolust ja suunas nad mööda eraldi rada. Laboriloomad olid esimesed, kes said saadud puhastatud rakumaterjali. Oli aeg hinnata ESC derivaatide kasutamise efektiivsust haiguste ja patoloogiliste protsesside mudelitel. Üks selline mudel oli eksperimentaalne Parkinsoni tõbi, mida loomadel paljundatakse hästi dopamiinergilisi neuroneid hävitavate keemiliste ühendite abil. Kuna inimestel põhineb haigus omandatud dopamiinergiliste neuronite puudulikkusel, oli asendusrakkude ravi kasutamine antud juhul patogeneetiliselt õigustatud. Eksperimentaalse hemiparkinsonismiga loomadel juurdus umbes pool ESC-dest saadud ja aju struktuuridesse viidud dopamiinergilistest neuronitest. Sellest piisas haiguse kliiniliste ilmingute oluliseks vähendamiseks. Katsed taastada kahjustatud KNS-struktuuride funktsiooni eksperimentaalsete insultide, vigastuste ja isegi seljaaju rebendite korral on osutunud üsna edukaks.

Siiski tuleb märkida, et peaaegu kõik diferentseeritud ESC derivaatide eduka kasutamise juhtumid eksperimentaalse patoloogia korrigeerimiseks viidi läbi simuleeritud patoloogilise olukorra ägedas perioodis. Kauge ravi tulemused ei olnud nii lohutavad: 8-16 kuu pärast kadus rakkude siirdamise positiivne mõju või vähenes järsult. Selle põhjused on üsna selged. Siirdatud rakkude diferentseerumine in vitro või in loco morbi viib paratamatult geneetilise võõruse rakuliste markerite ekspressioonini, mis kutsub esile retsipiendi organismi immuunrünnaku. Immunoloogilise kokkusobimatuse probleemi lahendamiseks kasutati traditsioonilist immunosupressiooni, millega paralleelselt hakati kliinilistes uuringutes mõistma autoloogsete hematopoeetiliste ja mesenhümaalsete tüvirakkude transdiferentseerumise ja geneetilise korrigeerimise potentsiaali, mis ei põhjusta immuunkonflikti.

Mis on regeneratiivne plastiline meditsiin?

Evolutsioon on määranud raku elu lõpu kaks peamist võimalust - nekroos ja apoptoos, mis koe tasandil vastavad proliferatsiooni ja regeneratsiooni protsessidele. Proliferatsiooni võib pidada omamoodi ohverduseks, kui kahjustatud koe defekti täitumine toimub selle asendamise tõttu sidekoe elementidega: säilitades struktuurilise terviklikkuse, kaotab keha osaliselt kahjustatud organi funktsiooni, mis määrab edasise kompenseerivate reaktsioonide arengu koos terveks jäänud struktuuriliste ja funktsionaalsete elementide hüpertroofia või hüperplaasiaga. Kompensatsiooniperioodi kestus sõltub primaarsete ja sekundaarsete muutuste tegurite põhjustatud struktuuriliste kahjustuste mahust, mille järel enamikul juhtudel toimub dekompensatsioon, kvaliteedi järsk halvenemine ja inimese eluea kestuse lühenemine. Füsioloogiline regeneratsioon tagab ümberehitusprotsessid, st vananevate ja surevate rakkude asendamise loomuliku rakusurma (apoptoosi) mehhanismide abil uutega, mis pärinevad inimkeha tüvirakkude reservidest. Reparatiivse regeneratsiooni protsessid hõlmavad ka tüvirakkude ressursse, mis aga mobiliseeritakse haiguse või koekahjustusega seotud patoloogilistes tingimustes, algatades rakusurma nekroosimehhanismide kaudu.

Teadlaste, arstide, ajakirjanduse, televisiooni ja avalikkuse tähelepanelikkus embrüonaalsete tüvirakkude (ESC) bioloogia uurimise probleemi vastu on tingitud eelkõige rakulise ehk, nagu me seda nimetame, regeneratiiv-plastilise teraapia suurest potentsiaalist. Meetodite väljatöötamine kõige raskemate inimeste haiguste (kesknärvisüsteemi degeneratiivne patoloogia, seljaaju ja ajukahjustused, Alzheimeri ja Parkinsoni tõbi, sclerosis multiplex, müokardiinfarkt, arteriaalne hüpertensioon, suhkurtõbi, autoimmuunhaigused ja leukeemia, põletushaigused ja neoplastilised protsessid moodustavad kaugeltki mitte täieliku loetelu) raviks põhineb tüvirakkude ainulaadsetel omadustel, mis võimaldavad luua uusi kudesid, mis asendavad, nagu varem arvati, haigestunud organismi pöördumatult kahjustatud koepiirkondi.

Tüvirakkude bioloogia teoreetilise uurimistöö edusamme viimase 10 aasta jooksul on kajastanud spontaanselt tekkivad regeneratiiv-plastilise meditsiini valdkonnad, mille metoodika on mitte ainult üsna süstematiseeritav, vaid seda ka nõuab. Tüvirakkude regeneratiivse potentsiaali esimeseks ja kiiremini arenevaks praktiliseks kasutusvaldkonnaks on saanud asendus-regeneratiiv-plastiline teraapia. Selle tee on teaduskirjanduses üsna kergesti jälgitav - alates müokardi nekroosiga loomadega tehtud katsetest kuni viimaste aastate töödeni, mille eesmärk on taastada kardiomüotsüütide infarktijärgne defitsiit või täiendada kõhunäärme β-rakkude ja kesknärvisüsteemi dopamiinergiliste neuronite kadu.

Rakkude siirdamine

Asendusliku regeneratiiv-plastilise meditsiini aluseks on rakkude siirdamine. Viimast tuleks defineerida kui meditsiiniliste meetmete kompleksi, mille käigus patsiendi keha puutub lühikese või pika aja jooksul otseselt kokku elujõuliste auto-, allo-, iso- või ksenogeense päritoluga rakkudega. Rakkude siirdamise vahendiks on tüvirakkude või nende derivaatide suspensioon, mis on standardiseeritud siirdamisühikute arvu järgi. Siirdamisühik on kultuuris olevate kolooniat moodustavate ühikute arvu ja siirdatud rakkude koguarvu suhe. Rakkude siirdamise meetodid: tüvirakkude või nende derivaatide suspensiooni intravenoosne, intraperitoneaalne, subkutaanne manustamine; tüvirakkude või nende derivaatide suspensiooni manustamine aju vatsakestesse, lümfisoontesse või tserebrospinaalvedelikku.

Allo- ja autoloogse rakusiirdamise puhul kasutatakse tüvirakkude pluri-, multi- või polüpotentse potentsiaali rakendamiseks kahte põhimõtteliselt erinevat metodoloogilist lähenemist – in vivo või in vitro. Esimesel juhul viiakse tüvirakud patsiendi organismi ilma nende eelneva diferentseerimiseta, teisel juhul pärast paljundamist kultuuris, sihipärast diferentseerimist ja puhastamist diferentseerumata elementidest. Asendusrakuteraapia arvukate metodoloogiliste võtete hulgas eristuvad üsna selgelt kolm meetodite rühma: luuüdi ja vererakkude asendamine, elundi- ja pehmete kudede rakkude asendamine ning keha jäikade ja tahkete elementide (kõhre, luu, kõõluste, südameklappide ja mahtuvuslike veresoonte) asendamine. Viimast suunda tuleks defineerida kui rekonstruktiiv- ja regeneratiivset meditsiini, kuna tüvirakkude diferentseerumispotentsiaal realiseerub maatriksi peal – bioloogiliselt inertsel või imenduval struktuuril, mis on kujundatud asendatud kehapiirkonna järgi.

Teine viis kahjustatud kudede regeneratiivsete-plastiliste protsesside intensiivsuse suurendamiseks on patsiendi enda tüvirakkude ressursside mobiliseerimine eksogeensete kasvufaktorite, näiteks granulotsüütide ja granulotsüütide-makrofaagide kolooniat stimuleerivate faktorite abil. Sellisel juhul viib stromaalsete ühenduste purunemine vereloome tüvirakkude vabanemise suurenemiseni üldisesse vereringesse, mis koekahjustuse piirkonnas oma loomupärase plastilisuse tõttu pakuvad regeneratsiooniprotsesse.

Seega on regeneratiivse meditsiini meetodid suunatud kaotatud funktsiooni taastamise protsesside stimuleerimisele - kas patsiendi enda tüvirakkude reservide mobiliseerimise või allogeense rakulise materjali sissetoomise kaudu.

Embrüonaalsete tüvirakkude avastamise oluliseks praktiliseks tulemuseks on terapeutiline kloonimine, mis põhineb embrüogeneesi käivitajate mõistmisel. Kui embrüogeneesi alguse algsignaaliks on munaraku tsütoplasmas asuv pre-mRNA kompleks, siis mis tahes somaatiliste rakkude tuuma viimine eemaldatud munarakku peaks käivitama embrüo arenguprogrammi. Tänapäeval teame juba, et embrüogeneesi programmi elluviimises osaleb umbes 15 000 geeni. Mis juhtub nendega hiljem, pärast sündi, kasvu-, küpsus- ja vananemisperioodidel? Sellele küsimusele andis vastuse lammas Dolly: need säilivad. Kasutades kõige kaasaegsemaid uurimismeetodeid, on tõestatud, et täiskasvanud rakkude tuumades säilivad kõik koodid, mis on vajalikud embrüonaalsete tüvirakkude, idukihtide, organogeneesi ja mesenhümaalse, ekto-, endo- ja mesodermaalse päritoluga rakuliinide restriktsioonküpsemise (diferentseerumise ja spetsialiseerumise) tekkeks. Terapeutiline kloonimine kui suund kujunes välja juba rakkude siirdamise arengu varases staadiumis ja näeb ette totipotentsuse taastamise patsiendi enda somaatilistes rakkudes, et saada geneetiliselt identset siirdamismaterjali.

Tüvirakkude avastamine algas „otsast“, kuna A. Maksimovi poolt bioloogiasse ja meditsiini sisse toodud termin viitas luuüdi tüvirakkudele, millest pärinevad kõik perifeerse vere küpsed rakulised elemendid. Kuid ka hematopoeetilistel tüvirakkudel, nagu täiskasvanud organismi kõigi kudede rakkudel, on oma, vähem diferentseerunud eelkäija. Absoluutselt kõigi somaatiliste rakkude ühine allikas on embrüonaalne tüvirakk. Tuleb märkida, et mõisted „embrüonaalsed tüvirakud“ ja „embrüonaalsed tüvirakud“ ei ole kaugeltki identsed. Embrüonaalsed tüvirakud eraldas J. Thomson blastotsüsti sisemisest rakumassist ja kanti üle pikaealistele rakuliinidele. Ainult nendel rakkudel on „ESC“ faksiimile. Leroy Stevens, kes avastas hiirtega tehtud katsetes embrüonaalsed tüvirakud, nimetas neid „embrüonaalseteks pluripotentseteks tüvirakkudeks“, viidates ESC-de võimele diferentseeruda kõigi kolme idukihi (ekto-, meso- ja endoderm) derivaatideks. Kuid kõik embrüo rakud hilisemates arenguetappides on samuti tüvirakud, kuna neist areneb tohutu hulk rakke, mis moodustavad täiskasvanu keha. Nende defineerimiseks pakume välja termini „embrüonaalsed pluripotentsed eellasrakud”.

[ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Tüvirakkude tüübid

Tüvirakkude tänapäevane klassifikatsioon põhineb nende jagunemise põhimõttel vastavalt nende võimele (potentsiaalile) tekitada rakuliine, mida defineeritakse kui toti-, pluri-, multi-, polü-, bi- ja unipotentsust. Totipotentsus ehk võime taasluua geneetiliselt programmeeritud organism tervikuna on sügootrakkudel, blastomeeridel ja embrüonaalsetel tüvirakkudel (blastotsüsti sisemise massi rakud). Teist totipotentsete rakkude rühma, mis moodustuvad embrüonaalse arengu hilisemates etappides, esindavad embrüonaalse suguelundite tsooni primaarsed germinaalrakud (suguelundite tuberkullid). Pluripotentsus ehk võime diferentseeruda mis tahes organi või koe rakkudeks on omane kolme idukihi - ekto-, meso- ja endodermi - embrüonaalsetele rakkudele. Arvatakse, et multipotentsus ehk võime moodustada mis tahes rakke ühe spetsialiseeritud liini piires on iseloomulik ainult kahele rakutüübile: nn mesenhümaalsetele tüvirakkudele, mis moodustuvad närviharjas ja on kõigi keha sidekoe baasi rakkude, sealhulgas neuroglia rakkude, eelkäijateks, samuti hematopoeetilistele hematopoeetilistele tüvirakkudele, millest saavad alguse kõik vererakkude liinid. Lisaks eristatakse bi- ja unipotentseid tüvirakke, eelkõige müeloidsete, lümfoidsete, monotsüütiliste ja megakarüotsüütiliste hematopoeetiliste võrsete eelkäijaid. Unipotentsete tüvirakkude olemasolu on selgelt tõestatud maksarakkude näitel - märkimisväärse osa maksakoe kadu kompenseeritakse diferentseerunud polüploidsete hepatotsüütide intensiivse jagunemisega.

Arengu käigus moodustuvad kõik organid ja koed blastotsüsti sisemise rakumassi proliferatsiooni ja diferentseerumise tulemusena, mille rakud on kitsamas tähenduses totipotentsed embrüonaalsed tüvirakud. Esimese töö embrüonaalsete tüvirakkude eraldamisel tegi Evans, kes näitas, et hiirte ajju implanteeritud blastotsüstid tekitavad teratokartsinoome, mille rakud kloonimisel moodustavad pluripotentsete embrüonaalsete tüvirakkude liine (nende rakkude algset nimetust - embrüonaalsed kartsinoomirakud või lühendina ECС - praegu ei kasutata). Neid andmeid kinnitasid mitmed teised uuringud, milles embrüonaalseid tüvirakke saadi hiirte ja teiste loomaliikide, aga ka inimeste blastotsüsti rakkude kultiveerimise teel.

Viimastel aastatel on kirjanduses üha enam käsitletud tüvirakkude plastilisust, mida peetakse mitte ainult viimaste võimeks diferentseeruda erinevat tüüpi rakkudeks erinevates arenguetappides, vaid ka läbida dedifferentseerumine (transdifferentseerumine, retrodifferentseerumine). See tähendab, et tunnistatakse põhimõttelist võimalust naasta somaatiliste diferentseerunud rakkude embrüonaalse arengu staadiumisse pluripotentsuse rekapitulatsiooni (tagasipöördumise) ja selle rakendamisega korduva diferentseerumise kaudu erinevat tüüpi rakkude moodustumisega. Eelkõige on teatatud, et hematopoeetilised tüvirakud on võimelised transdifferentseeruma hepatotsüütide, kardiomüoblastide ja endoteliotsüütide moodustumisega.

Teaduslikud arutelud tüvirakkude jagunemise üle vastavalt nende plastilisusele jätkuvad, st rakkude siirdamise terminoloogia ja sõnastik on kujunemisjärgus, millel on otsene praktiline tähtsus, kuna enamik regeneratiivse plastilise meditsiini meetodeid põhineb plastiliste omaduste kasutamisel ja tüvirakkude võimel diferentseeruda erinevateks rakuliinideks.

Regeneratiivse plastilise meditsiini fundamentaalsete ja rakenduslike probleemide valdkonna publikatsioonide arv kasvab kiiresti. Tüvirakkude regeneratiivse plastilise potentsiaali optimaalsele kasutamisele on suunatud mitmesugused metodoloogilised lähenemisviisid. Kardioloogid ja endokrinoloogid, neuroloogid ja neurokirurgid, transplantoloogid ja hematoloogid on tuvastanud oma pakilise huvi valdkonnad. Silmaarstid, ftiisioloogid, pulmonoloogid, nefroloogid, onkoloogid, geneetikud, lastearstid, gastroenteroloogid, terapeudid ja lastearstid, kirurgid ja günekoloogid otsivad lahendusi tüvirakkude plastiliste võimete pakilisele probleemile - kõik tänapäeva meditsiini esindajad loodavad saada võimaluse ravida haigusi, mida varem peeti surmavaks.

Kas rakkude siirdamine on järgmine "imerohi"?

See küsimus tekib õigustatult kõigil mõtlevatel arstidel ja teadlastel, kes analüüsivad meditsiiniteaduse praegust seisu. Olukorda teeb keeruliseks asjaolu, et teadusliku vastasseisu väljal on ühel pool „terved konservatiivid“, teisel pool aga rakkude siirdamise „haiged fanaatikud“. Ilmselgelt on tõde, nagu alati, nende vahel – „eikellegimaal“. Puudutamata õiguse, eetika, religiooni ja moraali küsimusi, vaatleme regeneratiiv-plastilise meditsiini määratletud valdkondade plusse ja miinuseid. ESC-de terapeutiliste võimaluste esimeste teaduslike aruannete „kerge tuuleiil“ muutus aasta pärast nende avastamist „tuulekõrvale“, mis 2003. aastal keerles „infotornaadoks“. Esimene publikatsioonide seeria käsitles embrüonaalsete tüvirakkude kultiveerimise, nende paljunemise ja suunatud diferentseerimise küsimusi in vitro.

Selgus, et embrüonaalsete tüvirakkude piiramatuks paljunemiseks kultuuris on vaja rangelt järgida mitmeid tingimusi. Konditsioneeritud söötmes peavad esinema kolm tegurit: interleukiin-6 (IL-6), tüvirakkude faktor (SCF) ja leukaasi inhibeeriv faktor (LIF). Lisaks tuleb embrüonaalseid tüvirakke kasvatada embrüonaalsete fibroblastide substraadil (rakkude toitjakihil) ja loote vasika seerumi juuresolekul. Kui need tingimused on täidetud, kasvavad ESC-d kultuuris kloonidena ja moodustavad embrüokehasid - sfääriliste rakkude suspensioonkloonide agregaate. ESC klooni kõige olulisem omadus on see, et kultuuris lõpetab embrüokeha kasv, kui agregaadis koguneb 50-60, maksimaalselt 100 rakku. Selle perioodi jooksul tekib tasakaaluseisund - rakkude jagunemise kiirus klooni sees on võrdne apoptoosi (programmeeritud rakusurma) kiirusega selle perifeerias. Pärast sellise dünaamilise tasakaalu saavutamist läbivad embrüokeha perifeersed rakud spontaanse diferentseerumise (tavaliselt munakollase endodermaalsete fragmentide, angioblastide ja endoteliotsüütide moodustumisega) koos totipotentsuse kaotusega. Seetõttu tuleb piisava koguse totipotentse rakumassi saamiseks embrüokeha igal nädalal lahti võtta, siirdades üksikud embrüonaalsed tüvirakud uude toitainekeskkonda - see on üsna töömahukas protsess.

Embrüonaalsete tüvirakkude avastamine ei vastanud küsimusele, mis täpselt ja kuidas käivitab sügoodi DNA-s krüpteeritud embrüogeneesi programmid. Jääb selgusetuks, kuidas genoomiprogramm inimese elu jooksul lahti rullub. Samal ajal võimaldas embrüonaalsete tüvirakkude uurimine välja töötada kontseptsiooni mehhanismidest tüvirakkude toti-, pluri- ja multipotentsuse säilitamiseks nende jagunemise ajal. Tüvirakkude peamine eristav tunnus on võime ise paljuneda. See tähendab, et tüvirakk, erinevalt diferentseerunud rakust, jaguneb asümmeetriliselt: üks tütarrakkudest annab aluse spetsialiseerunud rakuliinile ja teine säilitab genoomi toti-, pluri- või multipotentsuse. Jäi selgusetuks, miks ja kuidas see protsess toimub embrüogeneesi kõige varasemates etappides, kui blastotsüsti jagunev sisemine rakumass on täielikult totipotentne ja ESC genoom on uinunud (uinunud, inhibeeritud) olekus. Kui tavalise raku jagunemisel eelneb dubleerimise protsessile tingimata terve geenikompleksi aktiveerimine ja ekspressioon, siis ESC jagunemisel seda ei juhtu. Küsimusele „miks“ saadi vastus pärast seda, kui ESC-des avastati eelnevalt eksisteeriv mRNA (pre-mRNA), millest osa moodustub follikulaarsetes rakkudes ja säilib munaraku ja sügoodi tsütoplasmas. Teine avastus vastas küsimusele „kuidas“: ESC-des leiti spetsiaalsed ensüümid, mida nimetatakse „editaasideks“. Editaasid täidavad kolme olulist funktsiooni. Esiteks pakuvad nad alternatiivset epigeneetilist (ilma genoomi osaluseta) pre-mRNA lugemist ja dubleerimist. Teiseks rakendavad nad pre-mRNA aktiveerimise protsessi (splaissimine - intronite, st RNA inaktiivsete lõikude, mis pärsivad valgusünteesi protsessi mRNA-l, väljalõikamine), mille järel algab rakus valgumolekulide kokkupanek. Kolmandaks soodustavad editaasid sekundaarsete mRNA-de moodustumist, mis on geeniekspressiooni mehhanismide repressorid, mis säilitavad kromatiini tiheda pakkimise ja geenide inaktiivse oleku. Sellistel sekundaarsetel mRNA-del sünteesitud valguproduktid, mida nimetatakse summutivalkudeks või genoomi kaitsjateks, esinevad inimese munarakkudes.

Nii esitletakse tänapäeval embrüonaalsete tüvirakkude surematute rakuliinide moodustumise mehhanismi. Lihtsamalt öeldes tuleb embrüogeneesi programmi käivitamise signaal, mille algstaadiumis moodustub totipotentne rakumass, munaraku tsütoplasmast. Kui selles etapis isoleeritakse blastotsüsti sisemine rakumass ehk ESC edasistest regulatiivsetest signaalidest, toimub rakkude isepaljunemise protsess suletud tsüklis ilma rakutuuma geenide osaluseta (epigeneetiliselt). Kui selline rakk varustatakse toitainetega ja isoleeritakse välistest signaalidest, mis soodustavad rakumassi diferentseerumist, jaguneb ja paljuneb see lõputult oma liiki.

Totipotentsete rakkude siirdamiseks kasutamise eksperimentaalsete katsete esimesed tulemused olid üsna muljetavaldavad: embrüonaalsete tüvirakkude viimine immunosupressantide poolt nõrgestatud immuunsüsteemiga hiirte kudedesse viis 100% juhtudest kasvajate tekkeni. Neoplasma rakkude hulgas, mille allikaks olid ESC-d, esines totipotentse eksogeense rakulise materjali diferentseerunud derivaate, eriti neuroneid, kuid teratokartsinoomide kasv vähendas saadud tulemuste väärtust olematuks. Samal ajal moodustasid L. Stevensi töödes kõhuõõnde viidud ESC-d suuri agregaate, milles fragmentaarselt moodustusid embrüonaalsed lihased, süda, juuksed, nahk, luud, lihased ja närvikude. (Kirurgid, kes avasid dermoidtsüste, peaksid selle pildiga tuttavad olema). Huvitaval kombel käituvad suspendeeritud hiire embrüoblastrakud täpselt samamoodi: nende viimine täiskasvanud immuunpuudulikkusega loomade kudedesse põhjustab alati teratokartsinoomide teket. Aga kui sellisest kasvajast eraldatakse puhas ESC-de liin ja viiakse kõhuõõnde, siis moodustuvad jälle kõigi kolme idukihi spetsiifilised somaatilised derivaadid ilma kartsinogeneesi tunnusteta.

Seega oli järgmiseks lahendamist vajavaks probleemiks rakulise materjali puhastamine diferentseerumata rakkude lisanditest. Kuid isegi väga kõrge sihipärase rakkude diferentseerumise efektiivsuse korral säilitab kuni 20% kultuuri rakkudest oma totipotentse potentsiaali, mis in vivo kahjuks realiseerub kasvaja kasvus. Veel üks looduse „lingupüüdja“ – meditsiinilise riski skaalal tasakaalustub patsiendi tervenemise garantii tema surma garantiiga.

Kasvajarakkude ja embrüonaalsete pluripotentsete eellasrakkude (EPPC-de), mis on arengus kaugemale arenenud kui ESC-d, vaheline seos on üsna ebamäärane. Meie uuringute tulemused on näidanud, et EPPC-de viimine rottidel erinevatesse siirdatavatesse kasvajatesse võib viia kasvajakoe lagunemiseni (G), kasvaja massi kiire suurenemiseni (D), selle vähenemiseni (E-3) või ei mõjuta neoplastilise koe spontaanse tsentraalse fokaalse nekroosi suurust (I, K). On ilmne, et EPPC-de ja kasvajarakkude interaktsiooni tulemuse määrab nende poolt in vivo toodetud tsütokiinide ja kasvufaktorite kogum.

Tähelepanuväärne on see, et embrüonaalsed tüvirakud, mis reageerivad täiskasvanud kudedega kokkupuutel kartsinogeneesiga, assimileeruvad ideaalselt embrüo rakumassiga, integreerudes embrüo kõikidesse organitesse. Selliseid kimääre, mis koosnevad embrüo enda rakkudest ja doonori ESC-dest, nimetatakse allofeenloomadeks, kuigi tegelikult ei ole nad fenotüüpilised kimäärid. Hematopoeetiline süsteem, nahk, närvikude, maks ja peensool läbivad maksimaalse rakulise kimäriseerumise, kui ESC-d viiakse varasesse embrüosse. On kirjeldatud ka suguelundite kimäriseerumise juhtumeid. Ainus ESC-de jaoks puutumatu tsoon on primaarsed sugurakud.

See tähendab, et embrüo säilitab oma vanemate geneetilise teabe, mis kaitseb nii perekonna kui ka liigi puhtust ja jätkumist.

Varase embrüo rakkude jagunemise blokeerimise tingimustes tsütoklasiini abil viib embrüonaalsete tüvirakkude viimine blastotsüsti embrüo arenguni, mille primaarsed sugurakud, nagu kõik teisedki, moodustusid doonori embrüonaalsetest tüvirakkudest. Kuid sel juhul on embrüo ise täielikult doonor, geneetiliselt võõras asendusemaduse kehale. Sellise loomuliku blokeerimise mehhanisme oma ja võõra päriliku teabe segunemise potentsiaali suhtes pole veel selgitatud. Võib eeldada, et sel juhul realiseerub apoptoosiprogramm, mille määrajad pole meile veel teada.

Tuleb märkida, et eri liikide loomade embrüogenees ei ole kunagi koordineeritud: ksenogeensete embrüonaalsete tüvirakkude retsipienteembrüo kehas organogeneesi doonorprogrammi rakendamisel sureb embrüo emakas ja resorbeerub. Seetõttu tuleks kimääride "rott-hiir", "siga-lehm", "inimene-rott" olemasolu mõista kui rakulist, mitte morfoloogilist mosaiiklust. Teisisõnu, kui ühe imetajaliigi ESC-d viiakse teise liigi blastotsüsti, arenevad alati emaliigi järglased, kelle hulgas leidub peaaegu kõigi organite enda rakkude hulgas inklusioone ja mõnikord struktuuriliste ja funktsionaalsete üksuste klastreid, mis koosnevad ESC derivaatide geneetiliselt võõrast materjalist. Mõistet "humaniseeritud siga" ei saa tajuda kui mingisuguse inimese intelligentsuse või väliste omadustega koletise nimetust. See on lihtsalt loom, kelle keharakkude osa pärineb sea blastotsüsti viidud inimese ESC-dest.

Tüvirakkude kasutamise väljavaated

On juba ammu teada, et hematopoeetiliste ja lümfoidsete liinirakkude genopatoloogiaga seotud haigused elimineeritakse sageli pärast allogeenset luuüdi siirdamist. Oma hematopoeetilise koe asendamine geneetiliselt normaalsete rakkudega sugulasdoonorilt viib patsiendi osalise ja mõnikord täieliku paranemiseni. Geneetiliste haiguste hulgas, mida allogeense luuüdi siirdamisega ravitakse, väärib märkimist kombineeritud immuunpuudulikkuse sündroom, X-seotud agammaglobulineemia, krooniline granulomatoos, Wiskott-Aldrichi sündroom, Gaucher' ja Hurleri tõbi, adrenoleukodüstroofia, metakromaatiline leukodüstroofia, sirprakuline aneemia, talasseemia, Fanconi aneemia ja AIDS. Peamine probleem allogeense luuüdi siirdamise kasutamisel nende haiguste ravis on seotud HbA1c-ühilduva sugulasdoonori valikuga, kelle edukaks otsimiseks on vaja keskmiselt 100 000 tüpiseeritud doonori hematopoeetilist koeproovi.

Geeniteraapia võimaldab korrigeerida geneetilist defekti otse patsiendi vereloome tüvirakkudes. Teoreetiliselt pakub geeniteraapia vereloomesüsteemi geneetiliste haiguste ravis samu eeliseid kui allogeenne luuüdi siirdamine, kuid ilma kõigi võimalike immunoloogiliste tüsistusteta. See nõuab aga tehnikat, mis võimaldab täisväärtusliku geeni efektiivselt üle kanda vereloome tüvirakkudesse ja säilitada selle ekspressiooni vajalikku taset, mis teatud tüüpi päriliku patoloogia korral ei pruugi olla väga kõrge. Sellisel juhul annab isegi puuduliku geeni valguprodukti väike täiendamine positiivse kliinilise efekti. Eelkõige hemofiilia B korral on 10-20% IX faktori normaalsest tasemest täiesti piisav, et taastada vere hüübimise sisemine mehhanism. Autoloogse rakulise materjali geneetiline modifitseerimine on osutunud edukaks eksperimentaalses hemiparkinsonismis (dopamiinergiliste neuronite ühepoolne hävimine). Rottide embrüonaalsete fibroblastide transfektsioon türosiinhüdroksülaasi geeni sisaldava retroviirusvektoriga tagas dopamiini sünteesi kesknärvisüsteemis: transfekteeritud fibroblastide intratserebraalne manustamine vähendas järsult Parkinsoni tõve eksperimentaalse mudeli kliiniliste ilmingute intensiivsust katseloomadel.

Tüvirakkude kasutamise väljavaade inimeste haiguste geeniteraapias on esitanud kliinikutele ja eksperimentaatoritele palju uusi väljakutseid. Geeniteraapia problemaatilised aspektid on seotud ohutu ja tõhusa süsteemi väljatöötamisega geenide transportimiseks sihtrakku. Praegu on geeniülekande efektiivsus suurtesse imetajarakkudesse väga madal (1%). Metoodiliselt lahendatakse seda probleemi mitmel viisil. In vitro geeniülekanne hõlmab geneetilise materjali transfektsiooni patsiendi rakkudesse kultuuris, millele järgneb nende tagasiviimine patsiendi kehasse. Seda lähenemisviisi tuleks pidada optimaalseks luuüdi tüvirakkudesse viidud geenide kasutamisel, kuna hematopoeetiliste rakkude kehast kultuuri ja tagasi ülekandmise meetodid on hästi väljakujunenud. Retroviiruseid kasutatakse kõige sagedamini geeniülekandeks hematopoeetilistesse rakkudesse in vitro. Suurem osa hematopoeetilistest tüvirakkudest on aga uinunud olekus, mis raskendab geneetilise teabe transportimist retroviiruste abil ja nõuab uute meetodite otsimist geenide tõhusaks transportimiseks uinunud tüvirakkudesse. Praegu kasutatakse geeniülekande meetodeid nagu transfektsioon, DNA otsene mikroinjektsioon rakkudesse, lipofektsioon, elektroporatsioon, „geenipüstol“, mehaaniline sidumine klaashelmestega, hepatotsüütide transfektsioon retseptorsõltuva DNA sidumisega asialoglükoproteiiniga ja transgeeni aerosooli sisestamine kopsude alveolaarse epiteeli rakkudesse. Nende meetodite abil DNA ülekande efektiivsus on 10,0–0,01%. Teisisõnu, olenevalt geneetilise teabe sisestamise meetodist võib edu oodata 10 patsiendil 100-st või 1 patsiendil 10 000-st. On ilmne, et tõhusat ja samal ajal ohutut terapeutiliste geenide ülekande meetodit pole veel välja töötatud.

Rakkude siirdamises allogeense rakulise materjali hülgamisprobleemi põhimõtteliselt erinev lahendus on embrüonaalsete pluripotentsete eellasrakkude suurte annuste kasutamine täiskasvanud organismi antigeeni homöostaasi kontrollsüsteemi taasinstalleerimise efekti saavutamiseks (Kukharchuk-Radchenko-Sirmani efekt), mille põhiolemus seisneb immunoloogilise tolerantsuse indutseerimises, luues uue immunokompetentsete rakkude baasi koos antigeeni homöostaasi kontrollsüsteemi samaaegse ümberprogrammeerimisega. Pärast EPPC suurte annuste sissetoomist fikseeritakse viimased harknäärme ja luuüdi kudedes. Harknäärmes diferentseeruvad EPPC-d spetsiifilise mikrokeskkonna mõjul dendriitrakkudeks, interdigitaalseteks rakkudeks ja epiteel-strooma elementideks. EPPC-de diferentseerumise käigus retsipiendi harknäärmes ekspresseeritakse koos retsipiendi enda peamise koesobivuskompleksi (MHC) molekulidega ka doonorrakkudes geneetiliselt määratud MHC molekule, st luuakse MHC molekulide topeltstandard, mille kohaselt realiseerub T-lümfotsüütide positiivne ja negatiivne selektsioon.

Seega toimub retsipiendi immuunsüsteemi efektorsideme uuendamine T-lümfotsüütide positiivse ja negatiivse selektsiooni teadaolevate mehhanismide kaudu, kuid MHC molekulide topeltstandardi - retsipiendi ja doonori EPPC-de - kaudu.

Immuunsüsteemi ümberprogrammeerimine EPPC abil mitte ainult ei võimalda rakkude siirdamist ilma järgneva pikaajalise immunosupressantide kasutamiseta, vaid avab ka täiesti uusi väljavaateid autoimmuunhaiguste ravis ja annab aluse uute ideede väljatöötamiseks inimese vananemisprotsessi kohta. Vananemismehhanismide mõistmiseks oleme esitanud keha tüvirakkude ammendumise teooria. Selle teooria põhisätte kohaselt on vananemine keha tüvirakkude suuruse püsiv vähenemine, mida mõistetakse kui regionaalsete ("täiskasvanud") tüvirakkude (mesenhümaalsed, neuronaalsed, vereloome tüvirakud, naha, seedetrakti, endokriinse epiteeli, ripsmelintvoltide pigmendirakud jne) kogumit, mis täiendavad vastava koe rakulisi kadusid keha ümberehituse protsessis. Keha ümberehitus on kõigi kudede ja organite rakulise koostise uuenemine tüvirakkude tõttu, mis jätkub kogu mitmerakulise organismi eluea jooksul. Tüvirakkude rakkude arv määratakse geneetiliselt, mis määrab iga tüvirakkude piiratud suuruse (proliferatiivse potentsiaali). Varre ruumide suurus omakorda määrab üksikute organite, kudede ja kehasüsteemide vananemiskiiruse. Pärast varre ruumide rakuliste reservide ammendumist määravad hulkrakulise organismi vananemise intensiivsuse ja kiiruse somaatiliste diferentseerunud rakkude vananemismehhanismid Hayflicki piiri piires.

Seega postnataalse ontogeneesi staadiumis võib tüvirakkude laienemine mitte ainult oluliselt pikendada eluiga, vaid ka parandada elukvaliteeti, taastades keha ümberehituspotentsiaali. Tüvirakkude laienemist saab saavutada allogeensete embrüonaalsete pluripotentsete eellasrakkude suurte annuste sisseviimisega, eeldusel, et retsipiendi immuunsüsteem samaaegselt ümber programmeeritakse, mis pikendab oluliselt vanade hiirte eluiga katses.

Tüvirakkude ruumi ammendumise teooria võib muuta olemasolevaid arusaamu mitte ainult vananemismehhanismide, vaid ka haiguse ja selle ravimitega indutseeritud ravi tagajärgede kohta. Eelkõige võib haigus areneda tüvirakkude patoloogia (onkopatoloogia) tagajärjel. Mesenhümaalsete tüvirakkude reservi ammendumine häirib sidekoe ümberehitusprotsesse, mis viib vananemise väliste tunnuste (kortsud, naha lõtvus, tselluliit) ilmnemiseni. Endoteelirakkude tüvirakkude reservi ammendumine põhjustab arteriaalse hüpertensiooni ja ateroskleroosi arengut. Harknäärme tüvirakkude ruumi esialgne väike suurus määrab selle varajase püsiva vanusega seotud involutsiooni. Enneaegne vananemine on keha kõigi tüvirakkude ruumide suuruse esialgse patoloogilise vähenemise tagajärg. Tüvirakkude reservide ravimite ja ravimiteta stimuleerimine parandab elukvaliteeti, lühendades selle kestust, kuna see vähendab tüvirakkude ruumide suurust. Kaasaegsete geroprotektorite madal efektiivsus tuleneb nende kaitsvast toimest vananevatele diferentseerunud somaatilistele rakkudele, mitte keha tüvirakkudele.

Kokkuvõtteks tahaksime veel kord märkida, et regeneratiiv-plastiline meditsiin on uus suund inimeste haiguste ravis, mis põhineb tüvirakkude regeneratiiv-plastilise potentsiaali kasutamisel. Sellisel juhul mõistetakse plastilisuse all eksogeensete või endogeensete tüvirakkude võimet implanteeruda ja tekitada uusi spetsialiseerunud rakuvõrseid haigestunud organismi kahjustatud koepiirkondades. Regeneratiiv-plastilise meditsiini objektiks on surmaga lõppevad inimeste haigused, mis on praegu ravimatud, pärilik patoloogia, haigused, mille puhul traditsioonilise meditsiini meetodid saavutavad ainult sümptomaatilise efekti, samuti keha anatoomilised defektid, mille taastamine on rekonstruktiiv-plastilise regeneratiivse kirurgia eesmärk. Meie arvates on veel vara pidada esimesi katseid taastada tüvirakkudest terveid ja funktsionaalselt täielikke elundeid eraldi praktilise meditsiini valdkonnaks. Regeneratiiv-plastilise meditsiini objektiks on tüvirakud, millel olenevalt nende saamisallikast on erinev regeneratiiv-plastiline potentsiaal. Regeneratiivse plastilise meditsiini metoodika põhineb tüvirakkude või nende derivaatide siirdamisel.